MÉMOIRES DU MUSÉUM NATIONAL D’HISTOIRE NATURELLE

Série A, Zoologie, Tome LXXXVI

ÉTUDE BIOLOGIQUE ET BIOCHIMIQUE

DE L'HORMONE GONADOTROPE

D'UN POISSON TÉLÉOSTÉEN, LA CARPE

(CYPRINUS carpio L.)

par

Élisabeth BURZAWA-GÉRARD

SOMMAIRE

ABREVIATIONS 5

INTRODUCTION T

MATERIEL ET METHODES 9

I. - Matériel de départ 9

II. — Méthodes biochimiques 9

A. Méthodes préparatives 9

1. — Percolation alcoolique 9

2. — Chromatographie et filtration sur gel 9

3. — Solubilisation fractionnée par le sulfate d'ammonium 10

4. — Electrophorèse préparative sur gel de polyaerylainide 10

B. — Méthodes de dosages chimiques 10

1. — Détermination des acides aminés 10

2. — Détermination des glucides . 10

C. — Méthodes analytiques 10

1. — Electrophorèse analytique sur gel de polyacrvlamide 10

2. — Ultracentrifugation 10

III. — Méthodes immunologiques II

IV. — Méthodes biologiques 11

A. — Dosage de l'activité gonadotrope sur des Vertébrés inférieurs 11

1. — L'Anguille 11

2. — Ive Cyprin 11

3. La Grenouille 12

4. — Le Têtard 13

I 5M "H 6 lliÊL-- 1

\ f’ArtlS/

\ Bibliothèque Centrale Muséum

F.I.ISABKTH Bl RZAVVA-tiÉRAHD

B. Dosage île l’activité gonadotrope sur le Rat 14

1. - Détermination de l'activité folliculostiniulante 14

2. -- Détermination de l'activité lutéinisante 14

C. — Dosage de l'hormone thyréotrope 14

V. — Préparations des solutions hormonales 14

A. — Extraits hypophysaires 14

B. — Produits purifiés 14

VI. — Méthodes statistiques !

VII. — Standard 15

Chapitre i. - PURIFICATION ET CARACTERISATION BIOCHIMIQUE DE L’HOR¬

MONE GONADOTROPE DE LA CARPE - COMPARAISON AVEC LES HORMONES

GONADOTROPES (LH ET FSH» DES MAMMIFERES

I. — Introduction 17

II. — Préparation 17

A. — Matériel de départ . . . 17

B. — Test biologique 18

C. — Protocole expérimental de la purification 19

1. — Percolation alcoolique 19

2. Chromatographie sur échangeurs d’ions 19

a) CMC 19

b) DF.AEC 19

3. Essai de fractionnement par solubilisation fractionnée

après précipitation au sulfate d'ammonium 23

4. Filtration sur Sephadex G 100 24

5. — Electrophorèse préparative sur gel de polyacrylamide 25

6. — Résumé 26

III. — Etude de l'état d'homogénéité 27

A. — Filtration sur Sephadex G 100 27

B. — Ultracentrifugation dans un gradient de saccharose 27

C. — Electrophorèse analytique 29

D. — Essai immunologique 32

1. — Immuno-électrophorèse 32

2. — Test radio-immunologique 32

F.. — Résumé ...... 32

IV. — Caractéristiques biochimiques . 32

A. — Composition chimique 32

1. — Composition en acides aminés 32

2. — Composition en glucides 32

B. — Constantes physico-chimiques 33

1. — Poids moléculaire 33

2. — Point isoélectrique 35

Source : MNHN, Paris

HORMONE GONADOTROPE DE LA CARPE 3

C. — Structure quaternaire 35

1. — Action «le l'urée 35

a) Sur l'activité biologique 35

b) Sur l'encombrement moléculaire . 35

2. - Effet du changement de pH 37

a) Sur l'activité biologique 37

b) Sur l'encombrement moléculaire 37

3. — Action de l’acide propionique M 39

n) Sur l'activité biologique 39

b) Sur l'encombrement moléculaire 39

4. — Essai de réassociation 39

5. — Propriétés de la fraction (A) obtenue après électrophorèse

préparative 40

D. Résumé 42

V. — Comparaison biochimique entre les hormones gonadotropes l.H et FSH

de Mammifères et l'hormone gonailotrope de Carpe 42

A. — Composition chimique 42

1. — Acides aminés 42

2. — Glucides . 44

B. — Constantes physico-chimiques . .... 44

C. — Effets des agents dissociants 45

D. — Conclusion 45

VI. — Discussion 45

A. — Préparation . 45

B. — Degré de pureté et structure quaternaire . 46

C. — Comparaison avec les hormones CH et FSH des Mammifères 47

Chapitre ii. — CARACTERISATION BIOLOGIQUE DF L'HORMONE GONADOTROPE

DE LA CARPE - COMPARAISON AVEC LES HORMONES GONADOTROPES DES

MAMMIFERES 48

I. — Introduction 48

III.

Action de la c-GTH sur la gona«le de Poissons Téléostéens : nature

hormonale de «'-GTH

A. — Régénération de la gonade du Cyprin hypophvsectomisé

1. — Résultats obtenus sur la gonade mâle

2. - Résultats obtenus sur la gonade femelle

B. Action de la c-GTH sur divers paramètres biochimiques de l’acti¬

vité gonadique

1. — Chez l’Anguille

2. — Chez le Cyprin

C. — Discussion et résumé

c-GTH

Etude du rapport d’activité----——-: unicité «le l’hor-

Hvpophvse «le Carpe

mone gonadotrope de la Carpe

A. — Résultats

Source : MNHN, Paris

ÉLISABKTH B( KZAWA-f. ÉBAHI)

B. - Discussion 56

C. — Résumé et conclusion 56

IV. — Comparaison sur différents receveurs de l'activité biologique de l’hor¬

mone gonadotrope de la Carpe a\ec celles îles LH et FSH des Mam¬

mifères 56

A. — Recherches de l'activité biologique des hormones gonadotropes des

Mammifères sur les Vertébrés inférieurs 56

1. — Anguille 59

a) LH 59

b) FSH 59

2. — Cyprin 59

fl) Régénération de la gonade île Cyprin hypophvsectomisé 59

b) Mesure de l'activité adénvl-cvclasique «le l'ovaire en pré-

vitellogénèse 59

3. - Amphibiens 59

B. Recherche de l’activité biologique de l'hormone gonadotrope de

la Carpe sur le Rat 60

1. — Déplétion de l'acide ascorbique de l'ovaire chez la Ratte

pseudogestante 60

2. — Augmentation de poids de l'ovaire de la Ratte prépuhère

traité par HCG 60

V. — Discussion 62

A. — "Nature hormonale 62

B. — Nombre des hormones 63

C. — Spécificité zoologique 66

CONCLUSIONS GENERALES 69

BIBLIOGRAPHIE 71

Source : MNHN, Paris

HORMONE (JONADOTl

CARPE

ABREVIATIONS

b-LH

FSH

o-FSH

GTH

cGTH

onc-GTH

HCG

PMS-G

TSH

ACTH

AMP. ATP

AMP.

RGS

DEAEC

CMC

ormone luléinisanle ovine

tiale du nom lalin du genre de l'animal précédera le sigle désignant l'honnon

souhaiterons préciser l'origine zoologique de la préparation hormonale, i

ormone luléinisanle bovine

ormone folliculostimulanle

ine folliculostimulanle ovine

me gonadostimulante

inc gonadostimulante de Carpe

■ ne gonadostimulante d'Oncorhynchus

me chorionique humaine

onadotropine de sérum de Jument gravide

me thyréotrope

ormone corticotrope

ou triphosphate d'adénosine

3' 5' monophosphate cyclique d'adénosine

rapport gonado-somalique

diéthylaminoéthylcellulose

carhoxyméthylcellulose

taux de sédimentation

acide aminé

Source : MNHN, Paris

HORMONE (.ONADOTI

K UK I.A CARPE

INTRODUCTION

L’hypophyse «les Poissons Téléostéens comme celle «les Mammifères exerce une action

décisive dans la stimulation «les gonades : l'hypophysectomie entraîne, dans la majeure partie

des cas observés, l'atrophie «les glandes génitales et la disparition des caractères sexuels secon¬

daires (cf. Pickford et Atz. 1957).

Quand nous avons commencé nos recherches, seules les hormones des Mammifères avaient

été purifiées. Fevold et al. (1951) furent les premiers à obtenir, à partir d'un extrait hypophy¬

saire, deux fractions, l'une agissant essentiellement sur le développement des follicules ovariens et la

spermatogenèse chez le Kat et qu’ils appelèrent « Follicle stimulating hormone » (FSH), et l'autre

responsable de la transformation des follicules en corps jaunes chez la femelle et stimulant la

sécrétion «les androgènes dans le tissu interstitiel chez le mâle. Cette dernière hormone fut

appelée «« Luteinizing Hormone » (I.H). Van I)yke et Wallen LAURENCE (1932) et Evans et al. (1936)

confirmèrent ces observations en isolant à partir de l’hypophyse deux fractions gonadotropes possédant

«les propriétés biologiques différentes.

Deux hormones gonadotropes «le ce type ont-elles été mises en évidence chez les Poissons

Téléostéens ?

Vivien (1939-1941-1952). Kazanskii (1951) en particulier, ont abordé cette question en étudiant

tout d'abord Faction d'hypophyse de Poisson (greffes ou injections d'extraits) sur des Poissons

hypophvsectomisés. Ils obtiennent une stimulation de la gona«le. stimulation qui est la plus

importante lorsque les extraits hypophysaires proviennent, d'une part d'animaux en période «le

fraie, et d’autre part d'espèces voisines «le celle «lu poisson receveur. Ces expériences, étant réalisées

avec des extraits bruts, ne permettent pas de savoir si les effets observés sont le fait «l'une ou

plusieurs substances actives (BliTLF.lt. 1940).

Un autre type d’expérience a consisté à étudier chez les Poissons l'action des préparations

purifiées de LH et FSH des Mammifères (cf. Pickford et Atz. 1957 et Hoar. 1969). Les préparations

«le FSH comluisent le plus souvent à des résultats négatifs. Les préparations de LH au contraire

produisent généralement une action sur la gamétogénèse et la stéroïdogénèse. Pickford (données

citées dans Pickford et Atz. 1957) obtient une augmentation du rapport gonadosomatique avec la

LH sur Fundulus hétérnclitus hypophyseetomisé. Sundararaj et Goswami (1966 a) stimulent l’ovu¬

lation avec la LH chez Hétéropneustes fossilis. Les travaux iI’Ashan (1966) et de Yamazaki (1965)

confirment ces résultats. Cepenilant. Hasler et Mf.yf.r (1942) n'observent aucune action de la LH chez

le Cyprin et sur ce même Poisson hypophyseetomisé Yamazaki et Donaldson (1968 a) n’induisent pas

la spermiation après l’injection «le LH et FSH alors que des réponses positives sont observées avec

des préparations d’hormone chorionique humaine. La maturation «le l'Anguille mâle (Fontaine M..

1936) mais non celle «les femelles (Fontaine M., 1939. Bruun et al., 1941) a été obtenue par injection

«le prolans. Toutefois, l'Anguille femelle mûrit après un traitement par les extraits hypophysaires

«le Carpe (Fontaine M. et al. 1964).

Source : MNHN, Paris

ÉLISABETH BUHZA

k-I.ÉKAHD

Ces résultats indiquent que certains paramètres île l’activité des gonades de Poissons peuvent

(directement ou non), être stimulés par les hormones gonadotropes des Mammifères mais ceci ne

prouve pas que l'hvpophyse des Poissons secrète des substances respectivement similaires à la LH

et à la FSH. En fait, bien que la possibilité de l'existence chez les Poissons d'une seule hormone

gonadotrope ait été envisagée par Butler (1940), la plupart des auteurs supposaient jusqu'à

ces dernières années que deux substances hormonales, respectivement de type LH et FSH. étaient

présentes dans l’hypophyse des Téléostéens.

De plus, les études que nous venons de résumer succinctement posent un second problème :

celui de la spécificité zoologique des hormones gonadotropes. HoUSSAY et al. (1929) furent les

premiers à suggérer l'existence d'une spécificité zoologique. De nombreux auteurs et en particulier

Creaser et Gorbman (1939) étayèrent cette conception sur la base d'expériences croisées réalisées

avec des extraits bruts d’hypophyses de divers Poissons, mais la présence d'inhibiteurs dans ces

préparations impures pourrait aussi expliquer les résultats obtenus. Toutefois l'existence d'une

réelle spécificité zoologique a été démontrée dans le cas de la TSH (Y.-A. Fontaine. 1969). Or la

TSH est, comme les hormones gonadotropes, une glycoprotéine et île plus, on a émis l'hypo¬

thèse que les diverses glycoprotéines hypophysaires pourraient être homologues, c'est-à-dire descendre

d'une même molécule ancestrale, même si elles exercent des fonctions différentes thyréotrope

ou gonadotrope (Y.-A. Fontaine, 1969). Cette hypothèse est renforcée par les récentes données

structurales obtenues par différents auteurs pour les hormones glycoprotéiques des Mammifères.

Les hormones LH. FSH et TSH sont constituées par deux chaînes peptidiques a et (3- Les chaînes a

de ces hormones sont similaires ou identiques (cf. PiERCE, 1971 et Papkoff. 1971).

La purification et la recherche de la nature chimique des molécules qui possèdent l'activité

gonadotrope chez les Poissons Téléostéens apparaît nécessaire afin d’une part, d'assigner à certaines

entités chimiques des activités biologiques bien définies et de déterminer le nombre des hormones

gonadotropes présentes dans l'hypophyse des Poissons, et d'autre part d'apporter des éléments

nouveaux à l'étude de la spécificité zoologique.

Nous décrirons tout d'abord les conditions de purification d’un facteur gonadotrope présent

dans l’hvpophyse d'un Poisson Téléostéen. la Carpe (Cvprinus carpio L.). et ses caractéristiques

chimiques seront étudiées. Ensuite les propriétés biologiques de ce matériel seront analysées.

.Nous montrerons ainsi qu'il s'agit effectivement de l'hormone gonadotrope de la Carpe. Cette

hormone sera, tant du point de vue chimique que biologique, comparée aux hormones LH et

FSH des Mammifères.

Source : MNHN, Paris

HOKMONK t.ONADOTHOPE DK LA CARPE

MATERIEL ET METHODES

I. MATERIEL DE DEPART : HYPOPHYSE DE CARPE

La poudre d'hypophyses de Carpe a été fournie par les Stoller Fisheries (Spirit lake Iowa

U.S.A.). C’est un matériel déshydraté et dégraissé par l'acétone. Les glandes proviennent d'ani¬

maux mâles et femelles, pesant de 3 à 4 kg. capturés au printemps. L'activité gonadotrope des

trois poudres reçues, déterminée sur le test de spermiation de la Grenouille présente des variations

qui ne sont pas statistiquement différentes (tableau I).

Tableau I

Activité gonadotrope (mesurée par le test de spermiation de la Grenouille)

des lots de poudre hypophysaire de Carpe

Poudre 1

Poudre II

Poudre III

D 50*

lig/grenouille

70,7

(58,9 -78,3)

42,3

(29,8 - 60,1)

50,6

(41,3-60,3)

Activité ***

U/mg

31,2

52,0

43,5

* Dose lexprimée en |A/grenouillei induisant 5(1". de réponses positives.

** Limites pour p = 0.95.

*** Activité gonadotrope exprimée en I , nig en terme de LH-NIH-S 1.

IL METHODES BIOCHIMIQUES

A. — Méthodes préparatives

1. — Percolation alcoolique.

Cette méthode a été décrite par Bâtes et al. (1959) et nous l’avons appliquée à la poudre

hypophysaire de Carpe. La poudre est mélangée au même poids d’hyflosupercell dans l'éthanol 95

Le « cake ». ainsi formé, est extrait successivement par des solutions alcooliques (teneur décroissante

en éthanol) saturées en \aCl (éthanol 76 NaCl 2 u „ - éthanol 57 NaCl 5 '■„).

2. — Chromatographie et filtration sur gel

Les chromatographies sur résines échangeuses d’ions (DEAEC et CMC) ont été effectuées selon

Sohek et al. (1956).

Source : MNHN, Paris

lft

ÉLISABETH BURZA W A-GÉRARD

Les filtrations sur gel Sephadex (G 10(1 - G 50) ont été conduites selon Fi.odin et Kii.i.ander

(1962). La filtration sur Sephadex conduit généralement à une séparation en fonction du poids

moléculaire. Le Sephadex G 50 a surtout été utilisé pour changer le tampon des solutions de

protéines non retardées sur ce gel.

3. — Solubilisation fractionnée par le sulfate d'ammonium

Les protéines à séparer sont précipitées par le sulfate d'ammonium. La préparation repose

24 heures à 4 "C puis on ajoute 10 g d'hyflosupercell et le mélange est placé dans une colonne, fin

gradient de concentration décroissant en sulfate d'ammonium est ensuite appliqué.

4. — Electrophorèse préparative sur gel de polyacrylamide

Nous avons appliqué le système préparatif développé par JoviN et al. (1964). L'appareil

Buchler est utilisé dans les conditions standard de concentration en acrvlaniide et de tampon

(cf. fig. 9).

B. — Méthodes de dosages chimiques

1. — Détermination des acides aminés

Les acides aminés libérées, après hydrolyse acide (HCl 6 N à 110 °C en tube scellé sous

atmosphère d'azote), sont recherchés après trois temps d'hydrolyse (24 - 48 - 72 heures) : et la

concentration de chacun d'eux sera extrapolée à la valeur maximale. Le dosage est effectué par

chromatographie des hydrolvsats sur colonnes de résines selon la technique île Moore et al. (1958)

au moyen de l'auto-analvseur Beckinan 120 B.

2. — Détermination des glucides

a) La teneur en hexoses totaux est déterminée après hydrolyse acide dans HCl 3 N pendant

4 heures à KM) "C. La méthode de dosage appliquée est celle décrite par Tsugita et Akabori (1959).

b) Les hexosamines ont été dosées par la méthode suivie par Neuhaus et Letzring (1957)

après hydrolyse acide (HCl 3 N) pendant 4 heures.

c) La recherche des sucres en C 5 a été conduite selon la méthode de Dische et

Shettles (1948).

C. — Méthodes analytiques

1. — Electrophorèse analytique sur gel de polyacrylamide

Cette méthode est appliquée selon Ornstein (1964) et dans les conditions standard de gels

et de tampons décrites par Davis (1964). Après la migration des protéines à analyser, les gels sont

placés dans une solution d’Amido Scharwtz. L'excès de colorant non fixé par les protéines est

éliminé par diffusion dans les bains d'acide acétique à 7 "...

Nous avons tenté de découper les gels analytiques pour localiser la position des protéines

possédant l’activité biologique. Les gels après la migration dans le champ électrique sont immé¬

diatement découpés en section île 1 mm. Les disques ainsi obtenus sont homogénéisés à l'aide

d'un broyeur de type Potter dans 1 ml de NaCl à 0,1 M. L’activité biologique est recherchée

dans les suspensions.

2. — Ultracentrifugation

Les ultracentrifugations en gradient de saccharose (5 à 20 %) sont réalisées selon Martin

et Ames (1961) et Y. -A. Fontaine et Condliffe (1964). La centrifugation (Ultracentrifugeuse

Spinco L/L 2) dure 15 heures à 65.000 tr mn. Des fractions de 10 gouttes (0.133 ml) sont recueillies,

sauf pour les gradients réalisés en milieu propionique M où des fractions de 15 gouttes (0.129 ml)

sont prélevées. Le dosage des protéines dans chaque fraction est réalisé par la méthode de LoWRY

et al. (1951) au moyen de l'auto-analyseur Technicon (Lachiver, données inédites). Dans le cas

des gradients réalisés en milieu propionique M, nous avons auparavant neutralisé chaque fraction

avec de la soude 0,5 N.

Source : MNHN, Paris

HORMONE GONADOTROPE DK I.A CARPK

III. METHODES IMMUNOLOGIQUES

Les anticorps correspondant aux proteines à étudier ont été obtenus après immunisation,

par la préparation G 139, d‘un Lapin albinos de race New-Zealand (fourni par M. Rivet,

17-Peyrolland ) pesant de 3 à 4 kg au moment du sacrifice, selon un protocole voisin de celui

décrit par Utiger et al. (1963). Les animaux reçoivent trois injections, toutes les deux semaines

d'une solution contenant 1 ni}i d'antigène dans 1 ml d'une solution de NaCl 0,15 M et émulsionnée

dans 1 ml d'adjuvant de Freund complet (Difco Laboratories Detroit Michigan). Les antisérums sont

obtenus 10 à 14 jours après la dernière injection.

L'antisérum contre la préparation BG 2-67 a été obtenu par immunisation d'un cobaye

(B. Breton et al, 1971). I.‘animal reçoit cinq injections de 250 pg de la préparation, additionnée

de substosan retard el d'adjuvant de Freund complet, les suivantes alternativement en Freund

incomplet et complet.

Les anticorps ainsi obtenus ont été étudiés par deux techniques :

— L’immuno-électrophorèse qui a été appliqué selon la méthode décrite par Ghabar (1960).

Nous avons utilisé l'appareil LKB.

B hormone liée ...

L'étude du rapport -- —-- ; -a permis la mise au point d un dosage radio-

F hormone libre

immunologique selon la technique décrite par Behson et al. (1956) et Breton et al. (1971).

IV. - METHODES BIOLOGIQUES

L’activité gonadotrope présente dans l'hypophyse de la Carpe a été étudiée sur de nombreux

receveurs et tout particulièrement chez les Vertébrés inférieurs. L’activité thyréotrope a été

également déterminée dans certains cas.

A. — Dosage df. l’activité gonadotrope sur des Vertébrés inférieurs

1. — L'Anguille (Anguilla anguilla L.)

Le test de fixation du phosphore radio-actif (sous forme de Na 2 H 32 P0 4 ) par le testicule de

l’Anguille a été utilisé selon la méthode de M. Fontaine (données inédites) dans les conditions

décrites précédemment (F,. Burzawa-Gérard et Y.-A. Fontaine, 1965). tas Anguilles proviennent

des étangs de Brière ou de la Somme.

2. — Le Cyprin (Carrassius aurai us L.)

Nous avons utilisé des Poissons de 10 à 15 kg (Scapex, Paris).

a) Les tests d'hydratation du testicule (Clemens et Grant, 1964) a été utilisé dans les

conditions précédemment décrites (E. Burzawa-Gérard et Y.-A. Fontaine, 1966).

b) L'étude de la régénération de la gonade mâle ou femelle du Cyprin hypophysectomisé

a été réalisé en collaboration avec R. Billard et B. Breton (I.N.R.A., Jouv-en-Josas). Les Cyprins,

pesant de 9 à 11 g, sont hypophvsectomisés par voie operculaire selon la technique de Chavin (1956).

Ils sont maintenus à 20 "C sous une photopériode de 14 heures à l’aide «le tubes fluorescents

« blanc super » en bassins de 300 1 d'eau contenant 0,2 u ,. de NaCl et oxygénés par air comprimé.

Trente-cinq jours après l’hypophysectomie. les Poissons reçoivent par injection intra¬

péritonéale trois fois par semaine les solutions hormonales.

Les animaux sont sacrifiés entre 20 et 70 jours de traitement. Les gonades sont pesées et fixées

dans le Bouin (Hollande), (.'hypophysectomie est contrôlée par l’examen des coupes histologiques

«le la région corresponilante du cerveau.

Source : MNHN, Paris

ÉI.ISABIÎTH BUK7.A WA-LÉRARD

L’étude histologique <ies gonades porte sur des coupes sériées de 5 (A d’épaisseur. L’analyse

quantitative de la spermatogenèse a été effectuée par M. Billard par comptage des différentes

cellules de la lignée spermatogénétique à l'aide d’un oculaire intégrateur.

c) L'activité adénvlcvclasique. dans un homogénat d'ovaire de Cyprin, a été déterminée

en collaboration avec Y.-A. Fontaine. Le principe de la méthode consiste à mesurer 32 P-AMP t

formé à partir de a 32 P-ATP placé dans le milieu d’incubation. Le dosage de l'AMP c formé est

réalisé selon la méthode de Krishna et al. (1968).

3. La Grenouille (Rana esculanta L.)

Le test de spermiation de la Grenouille a été appliqué selon la technique mise au point par

Fontaine et Chauvel (1961).

Des animaux mâles pesant de 14 à 15 g provenant de Vendée (M. Blrlaud, Saint-Hilaire-

de-Riez) sont placés dans une chambre froide à 10 "C où ils sont maintenus de 8 à 15 jours. La

veille du dosage, ils sont placés à 20 "C. Ils reçoivent par injection dans les sacs lymphatiques

dorsaux 0,5 ml de la solution à doser : 2 heures après, on recherche au microscope la présence

de spermatozoïdes dans l'urine. On utilise généralement 10 Grenouilles par dose et le résultat

est exprimé en pourcentage d'animaux positifs, c'est-à-dire présentant des spermatozoïdes dans

l’urine (l'absence de ceux-ci ayant été vérifiée avant l'injection).

Une régression linéaire entre le pourcentage de réponse positive, exprimé en probit, et le

logarithme de la dose est obtenu (fig. 1). La dose moyenne effective peut être définie; elle

Probit

°50

Dose injectée par animal (pg)

Figure 1

Test de spermation de la grenouille - Réponse obtenue

avec l’hormone de référence (LH-NIH-S1)

Définition de la dose moyenne D50+ déviation standard

a et a’ selon Emmens (1Ô48)

Source : MNHN, Paris

IIOUMOM (.O.NADO'litOPK DK LA U

représente la close qui. injectée aux Grenouilles, induit 50 % de réponses positives. Elle sera

représentée par le symbole D 50. Sa détermination permet une comparaison facile de l’activité

gonadotrope présente dans différents extraits. Un deuxième mode d'expression de l’activité gona¬

dotrope a également été utilisé : l'activité gonadotrope de la poudre hypophysaire peut être

comparée à celle d’un standard hormonal. Nous avons utilisé dans ce but la LH-NIH-S 1. L’activité

gonadotrope est alors exprimée en unité de LH par nig de la poudre à doser. Une unité de

LH est l’activité présente dans 1 mg de I.H-MH-S 1. Nous avons eniplové également l'expression

mg LH-.NIH mg.

Cependant, certaines précautions doivent être prises : si la D 50 d’une même préparation

d’hypophyses de Carpe reste sensiblement constante au cours de l’année, il n’en est pas de

même avec la préparation I.H-NIH (fig. 2). Toutefois, le parallélisme des relations Log dose-Probit

obtenues avec la LH-NIH-S 1 et l’extrait hypophysaire de Carpe est vérifié (x 2 diff. = 0,34 p > 0,05).

Aussi une période de référence a-t-elle été choisie où la I) 50 pour la LH ne varie sensiblement

pas. Toutes les valeurs exprimées, dans ce travail, en terme de LH-NIH ont été mesurées au

cours de cette période.

D 50 (ig/animal [OH] UE. |ig/animal 1 c - G T H

Variation comparée de la D50 au cours de l'année pour l'hormone de référence LH-NIH-S1 et pour l'hormone

gonadotrope de la Carpe.

T Les limites de confiance sur D50 (p - 0,95) sont figurées par un segment de droite vertical.

4. Le Têtard (.4 lytes obstetricans L.)

\a- testicule du Têtard, sous l’influence d’extraits gonadotropes, présente un gonflement

caractéristique (Delsol. 1959 - Delsol et Flatin, 1964). Cette réaction a été utilisé pour mettre

au point un dosage biologique que nous avons appliqué dans les conditions décrites par Lkkay

( 1963). Nous remercions le Professeur Delsol qui nous a procuré les Têtards pour réaliser cette

expérience.

Source : MNHN, Paris

ÉLISABETH Bl!R/AWA-«;ÉUARD

B. I)osa«;k dk i .‘activité conadotropf. si’R i.k Rat

1. Détermination de /’activité folliciilostinmlante

Le dosage de l'activité follieulostimulante a été réalisé selon la méthode de Stkki.man et

POHLKY (195:1).

2. Détermination de l'activité lutéisinante

Le dosage de l’activité lutéinisante a été réalisé selon la méthode de Parlow (1961) dans

les conditions modifiées selon Pki.letier (1963). ce qui permet d’obtenir une meilleure réponse avec

les Rattes de souche Wistar que nous utilisons au laboratoire.

C. — Dosai.k dk i.’hormone thyréotrope

La détermination de l’activité thyréotrope dans nos préparations a été réalisée sur la

Truite (Salmo gardenerii L. ) selon la méthode décrite par M. Fontaine et Y.-A. Fontaine (1956)

et Y.-A. Fontaine (1969). KUe consiste à mesurer la fixation d’iode radio-actif par la thyroïde

de la jeune Truite à jeun.

Y. PREPARATIONS DES SOLUTIONS HORMONALES

A. Extraits hypophysaires

Ils ont été obtenus par la méthode décrite par Y.-A. Fontaine (1955). La poudre hypo¬

physaire est successivement congelée et décongelée dans NaCl 0.1 M pour les Poissons et Amphibiens

ou 0,15 M pour les Mammifères. Après centrifugation, le surnageant éventuellement dilué est injecté

aux animaux. Cependant, une simple suspension de poudre acétonique broyé dans NaCl 0,1 Ma été

injecté aux Cyprins au cours des expériences de régénération de la fonction des gonades des Cyprins

hypophysectomisés.

B. - Produits purifiés

Les produits purifiés ont été dissous dans des solutions de NaCl 0.1 M ou 0,15 M selon le

receveur choisi. De plus, lorsque la concentration du produit à doser devient inférieure à 5 pg ml.

nous utilisons une solution contenant une protéine étrangère inerte telle que la gélatine ou le

sérum albumine bovine, afin d’éliminer les effets dénaturants d'une trop grande dilution (Y.-A. Fon¬

taine, 1969). Nous avons employé la solution suivante : gélatine 1 g/l ; NaCl 0.1 M ou 0.15 M :

tampon phosphate 0.02 M pH 7.0.

VI. METHODES STATISTIQUES

A. - Les données énumératives (réponses individuelles) ont été étudiées statistiquement

par la détermination de la moyenne y et de l'erreur type de la moyenne s. Le test d’homogénéité

a été appliqué lorsque plusieurs moyennes y,. y 2 . y } ont été comparées. Les régressions Y = Log (X)

où X représente la dose du produit injecté par animal sont linéaires dans un certain intervalle de

doses pour les différentes techniques que nous avons employées.

La linéarité a été étudiée par l’analyse de variance et le parallélisme de deux ou plusieurs

Ln rapport d'activité peut ensuite être calculé ainsi que ses limites d'erreur pour p - 0.95.

Source : MNHN, Paris

HOKMONK I.OVWIOTKOPK

B. l-es données discontinues (réponses du tout ou rien) ont également fait l'objet d'une

étude statistique.

Lorsque le pourcentage de réponses positives p est transformé en probit Y. la variation

devient alors du type Y = Log (X) où X représente la dose. Les régressions, que nous avons

obtenues pour les dosages réalisés dans ce travail, sont généralement linéaires pour un certain

intervalle de doses. Les méthodes de calcul statistique appliquées sont celles décrites par

Emmens (1948) (pp. 131 à 168). I.e test île x 2 permet d'estimer la linéarité de la régression. La dose

moyenne effective (D50) est la close qui produit 50 de réponses positives (probit — 5). Les limites

d'erreur de D 50 sont déterminées pour p - 0.95. Le parallélisme de deux ou plusieurs régressions

est estimé par la détermination de x 2 - l'n rapport d'activité est calculé avec les limites d’erreur

pour p =• 0.95.

VII. - STANDARD

Nous avons utilisé les standards gonadotropes NIH principalement grâce à l'obligeance de

l’Endocrinology studv Section. N.I.H.. Bethesda. Maryland. Nous avons également utilisé les

préparations FSH et LH d'origine ovine que le Docteur JuTlSZ (C.N.R.S.. Gif-sur-Yvette) a mis à

notre disposition.

L’activité thyréotrope est déterminée relativement à une préparation de b-TSH (Armour

Ix»t M-69-112).

Source : MNHN, Paris

HORMONE (;ONADOTKOPK UK Lü

(A Kl* K

CHAPITRE I

PURIFICATION ET CARACTERISATION BIOCHIMIQUE

DE L'HORMONE GONADOTROPE DE LA CARPE

COMPARAISON AVEC LES HORMONES GONADOTROPES (LH ET FSH)

DES MAMMIFERES

I. - INTRODUCTION

Les données biochimiques concernant la nature des protéines possédant une activité gona-

dotrope chez les Poissons Téléostéens sont encore fragmentaires et les connaissances ne sont pas

aussi étendues que celles relatives aux hormones gonadotropes des Mammifères pour lesquelles

deux hormones de caractéristiques distinctes ont été définies. Quand nous avons commencé ce

travail, seul OtsüKA (1957) avait tenté de purifier à partir d’hypophyses de Saumon les hormones

gonadotropes. Cet auteur définissait, mais à l’aide des tests d'activité gonadotrope des Mammifères,

une LH et une FSH.

Le problème préalable à la purification d’une hormone gonadotrope de Poisson Téléostéen

était celui du choix d'une méthode île dosage biologique. Comme nous le verrons, les tests classiques

où les receveurs sont des Mammifères ne sont pas utilisables. D'un autre côté, il n'existait pas île

méthode simple de dosage sur les Poissons Téléostéens. En conséquence, nous avons choisi comme

test la spermiation de la Grenouille qui présente l'intérêt d'être induite à la fois par les hormones

gonadotropes des Mammifères et les extraits hypophysaires de Poissons Téléostéens (Fontaine et

CHAUVEL, 1916). Ce manque apparent de spécificité zoologique de réponse, sur lequel nous revien¬

drons, permettait d'espérer que toutes les substances gonadotropes éventuellement présentes dans

l'hypophyse de la Carpe seraient ainsi mises en évidence.

Dans une première série d'expériences (Y.-A. Fontaine et E. Gérard. 1963), nous avons

préparé, à partir d'hvpophvses de Carpe, une fraction gonadotrope sept fois plus active que la

poudre de départ, ce qui avait permis d'acquérir les premières données biochimiques concernant

une hormone gonadotrope de Poisson.

Ensuite nous avons mis au point un protocole de purification plus complexe qui fournit une

poudre vingt à trente fois plus active que l'extrait brut d’hypophyses de Carpe et dont l'activité

spécifique est élevée (1,5 U Tng en terme de 1.H-NI H-S 1).

Après la description de la purification, nous étudierons l’état d'homogénéité et les caracté¬

ristiques biochimiques du matériel purifié. Dans une dernière partie, nous comparerons les données

biochimiques obtenues à celles qui concernent les hormones LH et FSH des Mammifères.

IL — PREPARATION

A. — Matériel de départ

Le choix de la Carpe a été dicté par la très grande richesse de son hypophyse en activité

gonadotrope. Des dosages réalisés sur des extraits hypophysaires d’autres espèces de Poissons

4 564 OU 6 2

Source : MNHN, Paris

îa

ÉLISABETH BURZAWA-i;ÉKAKD

Téléostéens ont montré que la I) 50 pour la plupart d'entre eux était plus élevée que celle obtenue

dans le cas de la Carpe (tableau II).

TA BLE AL II

Activité gontulolrope tics hypophyses tic divers Poissons Téléostéens

Détermination tic la I) 50 par le le*' ilt spermiation tic la l.rcnotiille

Nom des Espèces

Etat génital

» 50(mg)

ANGUILLE

Anguilla anguilla

argentée

mure

2. 000

250

CARPE

Cyprinus carpio

Aristichtchys nobilis

Hypophtalmichthys

molitrix

indéterminé

250

SAUMON *

Salmo sa la r

/frayant d hiver

* " "

5. 500

7. 500

PROTOPTERE

Protopterus annectens

indéterminé

* Calculé d'après les données de Konlaine et Cliauvei (1964).

B. — Test biologique

Le test de spermiation de la Grenouille a été utilisé comme méthode de routine. La possibilité

de déterminer rapidement et simplement le pic d'activité après un fractionnement rend l'emploi

de ce test particulièrement intéressant, bien qu'il soit souvent critiqué pour son manque de

spécificité. En effet, certaines amines, comme l'adrénaline, stimulent à forte dose la spermiation

des Batraciens (Cresseri et Bovacqua, 1950). Cependant, au cours des différentes méthodes de

fractionnement que nous avons employées, l'activité gonadotrope apparaît être toujours concentrée

en un pic unique de protéines. En particulier, la filtration sur Sephadex G 100 d'un extrait brut

d'hypophyses de Carpe conduit à l'élution de l'activité gonadotrope en un seul pic possédant un

coefficient d'exclusion K D = 0.28. La recherche de l'activité dans les autres fractions, et plus parti¬

culièrement dans celle exclue pour K D - 1. s'est révélée négative dans les conditions de dosage

utilisées. Kilhstrom et Danninge (1970), Kilhstrom et al. (1972) ont suggéré que la spermiation

de la Grenouille pouvait être également produite par des facteurs non gonadotropes, présents dans

l'hypophvse de nombreux Vertébrés mais représentés en très petite quantité chez les Poissons

et les Oiseaux. Ils obtiennent, en effet, une libération de spermatozoïdes dans l’urine des Grenouilles

qui reçoivent les extraits hypophysaires (obtenus par traitement à l’acide acétique à 0,25 à 100 "C

suivi d’une lvophylisation. ces extraits secs sont ensuite dissous dans du tampon Ringer et chauffés

à 100 "C quelques instants). La nature non gonadotrope de la substance active est suggérée en

raison des conditions d'extraction très dénaturantes pour les hormones glycoprotéiques. .Nous avons

Source : MNHN, Paris

IIOKMDNF I.ON UIOTHOI'F

LAItl'K

obtenu un résultat similaire avec l'hypophyse «le la Carpe mais 10 seulement île l'activité biolo¬

gique île départ est retrouvée, après un traitement excluant l'ébullition à 100 "C de l'extrait final.

Il faut noter que ces auteurs injectent des quantités importantes d'hypophyses, d'une part, et

que, d'autre part, ils n'obtiennent pas de réponse positive avec l'extrait hypophysaire de Perche.

Cependant, il ne semble pas impossible d'interpréter notre résultat positif avec l'extrait hypo¬

physaire de Carpe de la façon suivante : même si le traitement appliqué au cours de l'extraction

conduit à une perte complète de l'activité de l’hormone, celle-ci peut être expliquée par une

dissociation de la molécule active en sous-unités inactives (K. Bt uzawa-Géhakd. 1971). l ue

réassocialion au cours de l'évaporation de l'acide acétique ne peut être exclue et rendrait compte

de la faible activité biologique retrouvée. Cette évaporation est réalisée au moyen d'un évaporateur

rotatif.

(J. — Protocole expérimental de i.a purification

1. — Percolation alcoolique

La figure 3 représente le diagramme d'élution obtenu pour l'extraction de 10 g d'hypophyses

de Carpe. La quasi-totalité de l’activité biologique est retrouvée dans la fraction soluble pour

57 % d'éthanol - 5 CINa. Les dosages biologiques réalisés dans les autres solutions d'extraction

n'ont pas permis de déceler la présence d'activité gonadotrope. Cette méthode permet, en une

seule étape, d'obtenir une fraction ne représentant que 2tl ", des protéines présentes dans le

matériel de départ et dont l'activité spécifique est de 0.20 1 mg (en terme de I.H-MH-S 1). Le

rendement est compris entre 70 et 90 "...

2. - Chromatographie sur échangeurs il'ions

Le matériel obtenu après la percolation contient aussi l'activité thyréotrope et nous avons

cherché à la séparer de l'activité gonadotrope.

a) CMC

La chromatographie sur CMC en tampon citrate phosphate pH 5.8 0.04 M en P<V permet

de séparer avec un rendement satisfaisant les hormones thyréotrope et gonadotrope de l'Anguille

(Y.-A. Fontaine. 1969). Des conditions analogues ont été appliquées à la Carpe : plus île 70 ",

du matériel restent non absorbés sur la CMC. La recherche dans les fractions adsorbée et non adsorbée

montre que 70 de l’activité est dans la fraction non adsorbée mais que la TSH est aussi présente

dans les deux fractions.

b) DEAKC

1" En tampon glycinate de sodium pH 9.5 (0,001 M).

Les activités gonadotrope et thyréotrope sont adsorbées sur la résine. I.'élution est obtenue

par l'établissement d’un gradient de force ionique, l^es deux activités sont éluées pour une

concentration moyenne de 0.1 M en \a .

Deux caractéristiques de la chromatographie sur échangeurs d'ions d'un extrait hypophysaire

de Carpe peuvent être dégagées dès à présent : 95 du matériel protéique restent adsorhés sur

la résine montrant ainsi le caractère acide des protéines présentes dans cet extrait, comparées à

celui des extraits correspondants des hypophyses de Mammifères (Parlow et al.. 1964). L'activité

gonadotrope est absente dans la fraction non adsorbée et elle est représentée par un pic unique

dans la fraction adsorbée.

Cependant, la séparation îles deux activités gonadotrope et thyréotrope n'est pas satisfaisante

dans ces conditions (fig. 4 A).

Source : MNHN, Paris

ÉLISABETH Bl.'RZAWA-I.ÉRAHI)

Percolation alcoolique de la poudre acétonique d'hypophyses de Carpe.

- Protéines (densité optique D.0.276 mp)

_ Activité biologique exprimée en terme de LH-NIH-B5 par ml.

Valeur maximale (aucune grenouille ne répond à la dose injectée.

2“ En tampon Tris-HCl pH 7,8 (0.005 M en Tris).

La séparation île la fraction thyréotrope est meilleure mais la fraction gonadotrope reste

encore contaminée (fig. 4 B). I ne nouvelle chromatographie dans les mêmes conditions de la

fraction qui contient la plus “ramie proportion de l'activité gonadotrope est décrite dans la figure 5.

La contamination en '1SH de cette fraction a été déterminée sur la poudre lyophilisée finale (après

filtration sur Sephadex G 100 en bicarbonate d'ammonium). Elle est faible (60 mu mg) et elle

représente en poids 3 pg mg au maximum. En conclusion, seule la chromatographie sur DKAEC

à pH 7,8 a été retenue. Les protéines éluées dans les deux premiers tiers du pic sont conservées.

Nous sacrifions ainsi le rendement en activité pour une moins grande contamination en TSH. La

fraction active récupérée après cette étape représente 40 de l'activité de départ. L’activité

spécifique est alors de 0,34 l mg.

Source : MNHN, Paris

H sSHEiHLI'LL IL

î éga““ou r iüf*««ürê e ii r cSïïe du’point* lnJe ‘

i s*s.;r.ns;x'!^sr a ; s,s~

*-à Activité thyréotrope.

Source : MNHN, Paris

22 ÉLISABETH BLRZAWA-LÉRARD

: la fraction

Figure 5

:tive obtenue après i

L'adsorption est obtenue en tampon Tris-HCl 0.005M e

par un gradient d'élution (tampon/NaCl 0,2M)

; première chromatographie s

; l'élution des protéines ac

3 Protéines (densité optique 276 mu)

* Activité gonadotrope exprimée en' terme de LH-NIH-S1 (U/ml)

Aucune grenouille ne répond à la dose injectée. La valeur de l'activité biologique

égale à celle représentée par le point.

Source : MNHN, Paris

HORMONE OONADOTROPK l)K I.A C'.ARPK

S. — Essai de fractionnement par solubilisation fractionnée

après précipitation au sulfate d'ammonium

Les résultats sont représentes dans la figure 6. Par cette méthode une séparation complète

des deux activités ne peut être obtenue mais l'activité spécifique de la fraction gonadotrope (après

filtration sur Sephadex G 100 et lyophvlisation) est élevée (0.6 U mg en ternie de LH-NIH-S 1).

Le rendement est inférieur à 30 "... De plus, les différentes expériences réalisées n'ont pas conduit

à des résultats reproductibles. Gette méthode n'a pas été retenue.

Solubilisation fractionnée après précipitation au sulfate d'ammonium de la fraction active obtenue après

chromatographie sur DEAE (pH 7,8)

■-■ Protéines (densité optique D.O. 276 rap)

• • Activité gonadotrope exprimée en terme de LH-NIH-S1 (test de spermiation de la grenouille)

k Toutes les grenouilles répondent à la dose injectée la valeur de l'activité gonadotrope est au moins

• égale à celle représentée par le point.

a- a Activité thyréotrope.

O-o (NH^)2®®4> concentration déterminée en fonction de la conductivité.

Source : MNHN, Paris

ÉLISABETH BURZA WA-GÉRAHD

4. — Filtration sur Sephadex G 100

La purification est poursuivie par une filtration sur Sephadex G 100 en bicarbonate d'ammo¬

nium (0,1 M) dans le cas des préparations de type I (G 52 ayant été chromato'traphié sur DEAKC

pH 9,2). Deux pics principaux de protéines sont élués avec un coefficient d'exclusion respecti¬

vement éjial à 0,28, 0,32 et 0.60. L'activité biologique est retrouvée dans le pic exclu le premier

(fig. T).

Filtration sur Sephadex G100 de la fraction active obtenue après chromatographie sur DEAE (pH 7,8)

tampon NHjHCOg (0,1M)

colonne 112 x 2 cm

O— O Protéines (densité optique D.O. 276 mp)

• • Activité biologique exprimée en terme de LH-NIH-S11 (pg/ml)

i Toutes les grenouilles répondent à la dose injectée ; la valeur de l’activité biologique est

au moins égale à celle représentée par le point.

a— -A Conductivité m MHO.

• Aucune grenouille ne répond à la dose injectée ; la valeur de l’activité biologique est au

T plus égale à celle représentée par le point.

Source : MNHN, Paris

HORMONE GONADOTROPE DK I.A CARPE

L’étal d’homogénéité de ces préparations a été recherché par électrophorèse analvtit|ue sur

gel de polyacrylamide. Après coloration à l'Amido Schwartz, on observe, d’une part, une zone de

protéines avec en général deux bandes plus nettes (Rf = 0.50 - 0.54) et. d’autre part, une line

bande (Rf = 0,80) (fig. 8). .Nous avons cherché à localiser la position de l’activité biologique

en la recherchant dans les gels après les avoir découpés en section de 1 min de hauteur. Klle est

décelable dans la zone de protéines de Rf compris entre 0.50 et 0.54. Les protéines de Rf 0.80

apparaissent inactives dans les conditions de cette expérience. L’activité biologique semble être

conservée après l’électrophorèse sur un support tel que le gel de polyacrylamide : en conséquence,

l'application d’une méthode d’électrophorèse préparative pouvait être envisagée.

©--©

Gel de concentration

- Gel de résolution

Front

Electrophorèse analytique sur gel de polyacrylamide de la

préparation BG 121 (type III)

tampon Tris-glycine pH 8,3 0,005M en Tris

durée 1 h 30

Intensité I = 2,5 raA

Les protéines sont révélées par 1’Amido-Schwartz après mi¬

gration et le front est visualisé par le bromophénol.

5. — Electrophorèse préparative sur gel île polyacrylamide

Les protéines à séparer sont précédemment filtrées sur Sephadex G 100 en tampon Tris-

phosphate pH 7.2 (0.05 M en Tris). Par électrophorèse préparative, une bonne séparation de la

fraction la plus électronégative est obtenue. Le maximum île l’activité gonadotrope est retrouvé

pour le maximum de protéines. Le Rf est de 0.50 - 0.54 (fig. 9). L'activité gonadotrope a été

aussi étudiée au moyen du test d'hydratation du testicule du Cyprin (Clemens et Grant. 1964).

Les maximums des pics d'activité déterminés, d'une part sur la Grenouille et d'autre part sur le

Cyprin, sont confondus. Nous observons de plus que les protéines les plus électronégatives ne sont

actives ni sur le premier receveur ni sur le second.

L’activité thyréotrope a été également recherchée après ce fractionnement. Celle-ci n'a pas

été retrouvée dans les conditions employées.

Quatre fractions (A), (B). (C) et (D) ont été recueillies à la suite de l’électrophorèse.

Elles ont été concentrées à l’évaporateur rotatif, filtrées sur Sephadex G 100 en NH 4 H C() 3 0,1 M.

puis lyophilisées. Leurs activités biologiques sont résumées dans le tableau III.

Tableai III

Activité gonadotrope des fractions séparées par électrophorèse préparative

après filtration sur Sephadex G 100 et lyophilisation

FRACTIONS

[B]

[»]

Activité gonadotrope

U/mg

<0,03

0,87

1,50

0,65

Source : MNHN, Paris

ÉLISABETH Bll RZ A WA -GÉRARD

Electrophorèse préparative sur gel polyacrylaraide de la fraction obtenue après filtration sur Sephadex G100

- la migration se fait vers l'anode, le front est visualisé par le bromophénol en tampon Tris-glycine 0.36M

en Tris pH 10,3.

- V = 200 volts au début de l'expérience I - 40 mA constante.

- colonne:gel de résolution h - 38 ram (7,5 % acrylamide monomère)

gel de concentration h = 20 mm (1,25 % acrylamide monomère)

- A la base de la colonne les protéines sont entraînées en tampon Tris-HCl 0,1M en Tris pH 8,1 à un débit

de 26 ml/h.

O—O Protéines exprimées en fonction de la densité optique à 276 myi.

Activité biologique en terme de LH-NIH-S11 (spermiation de la grenouille).

Toutes les grenouilles répondent à la dose injectée.

^ Aucune des grenouilles ne répondent à la dose injectée.

* La densité optique après élution d'un pic de protéine ne revient pas à 0,00 en raison de l'en¬

traînement de certaines particules de gel adsorbant à 276 mp. Celles-ci seront éliminées dans

le pic de sel au cours de la filtration sur Sephadex suivante.

Source : MNHN, Paris

HORMONE LOMDOTROPE DE I.A CARPE

6. Résumé

L'application de ces diverses techniques de fractionnement a permis d’élaborer un protocole

(tableau IV) conduisant à la préparation d'une, et d'une seule, fraction hautement purifiée

possédant une activité gonadotrope élevée.

Tableau IV

Schéma de la purification

PKRCOLATION ALCOOI.IQI h

Fraction soluble dans

( Concentration

FILTRATION SLR SKPHADKX G 50 [Tampon Tris-HCl pH 7.8 (0.05 M Tris»)

Fraction active éluée par un gradient de force ionique (tampon NaCI 0,4 M) pour une

conductivité comprise entre 3.1 et 3.9 m MHO

Concentration

CHROMATOGRAPH1K SLR DKAKC équilibrée en tampon Tris-HCl pH 7.8]

Fraction active éluée par un gradient de force ionique

Concentration

FILTRATION SLR SKPHADKX G 100 iKquilibrée en tampon Tris-phosphate pH 7,ij

1(0.0587 M Tris)

Fraction active éluée pour K D compris entre 0,26 et 0.32

RLKCTROPHORKSK PRKPARATIVK SUR GKL DK POLYACRYLAMIDK

Migration vers l'anode en tampon Tris-glycine

pH 10.3 (0,36 M Tris)

Fraction active pour Rf = 0.54

Concentration

FILTRATION SUR SKPHADKX G 1(M)

Pic actif (K 0 - 0.28) _

l.yophvlisation

Source : MNHN, Paris

28 ÉLISABETH BI'R/.A WA-CÉRAHD

Pour la suite «le ce travail, nous avons utilisé différentes poudres ayant été préparées selon

des protocoles distincts. Nous donnons dans le tableau Y la désignation et le mode de séparation

utilisés pour chacune «l'entre elles avec les activités spécifiques obtenues après chaque étape

importante.

Tableau V

Activités gonadotropes (l I.H-MH-S 1) des principales préparations

obtenues aux étapes principales de leur purification

OEAE-C

pH 9,2

DEAE-C

pH 7,8

H eme DEAE-G

pH 7,8

(NH4) 2 S0 4

Sephadex

G100

Electrophorèse

préparative

Type I

G 52

Type H

G139-G164

0,30 —

Type Kl

]>oe Iï

do 2 - 67

BG 2-116

"" i_i_i

III. - ETUDK DK l.'KTAT D'HOMOGENEITE

D'état d'homogénéité des préparations de types 1 et IV a été étudié par filtration sur

Sephadex G 100. ultracentrifugation dans un gradient de saccharose et par électrophorèse analy¬

tique sur gel de polyaervlamide. De plus, quelques essais concernant les caractères immunolo¬

giques de cette protéine ont été réalisés sur les préparations de types II et IV.

A. — Filtration sur Sephadex G 100

Elle constitue la «lernière étape de la purification et permet de sélectionner les molécules

essentiellement en fonction «le leur poids moléculaire. La figure 10 représente les résultats obtenus

pour la préparation «le type IV. Le pic de protéine n’est pas parfaitement symétrique (présence

d'un épaulement « F, » et l'activité spécifique est plus faible dans la partie descendante que dans

la partie ascendante «le ce pic). En conséquence, seules les protéines exclues dans la première

partie du pic ont été conservées. Iaïs critères d'ultracentrifugation et d'électrophorèse analytique

ont été réalisés sur cette poudre finale.

Une nouvelle filtration de ce matériel révèle la seconde apparition de l'épaulement (fig. 11 B).

Les coefficients «l'exclusion sont «le K = (1.28 pour le pic principal et K = 0.42 pour l’épaulement.

Les rayons de Stokes correspondant ont été calculés selon Courte (1970) R| = 31,3 À et R 2 = 24.6 Â.

La préparation apparaît «lonc être contaminée par une protéine de poids moléculaire plus faible.

B. — l LTRACENTHlKt (LATION DANS UN (GRADIENT DE SACCHAROSE

L’ultracentrifugation de la préparation «le type I (G 52) a été réalisée et nous avons simul¬

tanément «losé sur les différentes fractions les protéines et l’activité biologique. Nous avons observé

que les courbes représentant l'activité biologique et les protéines sont superposées. Relativement

au pepsinogène, le poids moléculaire de la préparation est de 33.000 environ (E. Bur/.AWA-GÉKAHD

el Y.-A. Fontaine. 1966). Une ultracentrifugation de la préparation hautement purifiée de type IV

Source : MNHN, Paris

HORMONE LONADOTHOPE UK LA CARPE 29

BG 2-67 a aussi été effectuée et les résultats obtenus sont représentés figure 11 A. lin épaulement

« E » apparaît ici également suggérant aussi la présence ilans la préparation d’une protéine conta¬

minante possédant un poids moléculaire inférieur. I.es taux de sédimentation du pic principal de

protéine et île l'épaulement sont respectivement de 2.6 et 1.8 correspondant à des valeurs d’environ

29.000 et 17.000 pour les poids moléculaires.

G. Electrophorèse analytique

Nous observons la présence de deux bandes principales dont les coefficients de partage sont

respectivement de 0.50 à 0.54 et de 0.80. Par ce critère faisant intervenir la charge en plus du poids

moléculaire, nous voyons apparaître une nouvelle fois des protéines de Kf - 0.80 que nous avions

pourtant éliminées au cours de l'électrophorèse préparative.

O-O Protéines (densité optique D.O. 276 mp)

» 9 Activité biologique exprimée en terme de LH-NIH-S11 (pg/ml)

« Aucune grenouille ne répond à la dose injectée, la valeur de l'activité biologique est au plus

égale à celle du point.

a —-a Conductivité m MH0.

Source : MNHN, Paris

ÉLISABETH BURZAWA-UÉRARD

D.0.75O mp llltracentritugation

A- Ultracentrifugation dans un gradient de saccharose de la pré¬

paration BG 2-67 (type IV)

(15 h à 65.000 t/mn) Centrifugeuse Spinco Mod. L/L2 Rotor SW65

Protéines densité optique D.O. 750 mji après réaction

de Lowry-Folin

B- Filtration sur Sephadex G100 de la préparation BG 2-67(type IV)

Protéines densité optique D.O. 276 mp.

Conductivité (m MHO)

Source : MNHN, Paris

HORMONE GONADOTROPE DE U

CARPE

Logit y

Etude immunologique de la glycoprotéine gonadotrope de la Carpe

A- Immunoélectrophorèse sur gel d'agar

- 5 )il de la solution antigénique (2 mg G139 dans 1 ml en tampon

véronal pH 8 , 6 ) sont placés dans le réservoir.

- la migration électrophorétique est réalisée pendant 1 h 30 sous

250 volts à 2 à 3 mA.

- 100 pl de sérum sont placés dans le canal central.

- les plaques sont colorées à l'Amido Schwartz et l'excès de colo¬

rant est éliminé par rinçage dans une solution de formol.

B- Radioimmunologie

Le complexe Anticorps-Antigène est étudié en présence de l'hormone

marquée à 131 I (préparation BG2-67)

Les variations du logit Y sont représentées en fonction du logarithme

de la dose d'hormone mise dans chaque tube

Logit Y = Log ou Y = -§3

B représente le nombre de coups par minute (cpm) correspondant

à l'hormone marquée liée à l'anticorps

Bo représente le nombre de coups par minute de 1 -'hormone mar¬

quée liée en présence d'hormone froide.

Source : MNHN, Paris

ÉI.ISABETH BI'RZAWA-«;ÉRARI>

D. Essai immlnoum.iqie

Les préparations G 139 (type II) et BG 2-6T (type IV) ont été injectées, la première à un

Lapin et la deuxième à un Gobaye, afin de préparer l'antisérum correspondant.

1. Immuno-élpctrophorpse

Les résultats expérimentaux sont représentés sur la figure 12 A. I<e schéma observé a été

obtenu avec la préparation G 139 et le sérum de Lapin anti-G 139. Deux lignes de précipitation

principales sont mises en évidence, elles correspondent aux deux zones révélées sur gel de polva-

crylamide (Rf - 0.50 et 0.80). Ces arcs ne se croisent pas. ce qui montre qu’il s’agit «le protéines

iminunologiquemenl voisines.

2. TpsI radio-immunologique

L'antisérum utilisé ici a été obtenu après immunisation d’un Cobaye par BG 2-67. La

variation du rapport — (hormone liée hormone libre) a été recherchée en fonction de la concen¬

tration hormonale du milieu d'incubation (B. Breton et al.. 1971). La régression est linéaire

lorsqu'on transforme la donnée expérimentale de —— en logit Y que l'on porte en ordonnée, le

logarithme de la «lose d’hormone étant porté en abcisses (Midleï et al.. 1969). L’application de

cette transformation à notre système (fig. 12 B) donne une droite de pente b = — 1.17 avec un

coefficient de corrélation r = 0.995. Ce résultat permet de conclure que l’anticorps est mono¬

composite (B. Breton, données inédites).

E. — Résumé

Les préparations les plus purifiées contiennent toujours à côté de la substance active un

contaminant inactif de comportement électrophorétique et d'encombrement moléculaire très diffé¬

rents de ceux du facteur actif. Cependant, «-e contaminant [fraction (A)] semble bien provenir

de la fraction principale et il possède des propriétés immunologiques communes avec celle-ci.

IV. - CARACTERISTIQUES BIOCHIMIQUES

-Nous avons recherché la composition chimique (acides aminés, sucres) et déterminé certaines

constantes physico-chimiques du produit purifié. Cette étude a été complétée par quelques essais

concernant la structure quaternaire de «•ette nmlécule protéique.

A. — COMPOSITION CHIMIQl K

1. Composition en acides aminés

Les résultats obtenus sont exprimés en nombre «le résidus et en résidus pour 100 résidus

analysés (tableau VI). La comparaison des concentrations en acides aminés des diverses prépa¬

rations à des états de pureté légèrement différents ne met en évidence que peu de différences.

En fonction du degré de pureté des préparations, la concentration en acide glutamique diminue

tandis que celles en glycine, leucine et surtout en valine augmentent : la méthionine reste parti¬

culièrement constante. La phénvlalanine a une concentration très élevée pour l'analyse de la

préparation BG 2-36 (type II) mais cette valeur peut être surestimée, car la glucosamine dans les

conditions de cette analyse était mal séparée «1e la phénvlalanine.

2. — Composition en glucides

Les sucres en Q - C5. les sucres aminés (glucosamine et galactosamine) ont été recherchés. Les

résultats obtenus pour différentes préparations sont résumés dans le tableau VII. La détermination

de l’aci«le sialique a été réalisée par le Docteur Robert.

Source : MNHN, Paris

HORMONE CONADOTROPF. UK LA CARPE

Ces résultats montrent que la substance gonadotrope purifiée à partir de l’hypophyse de la

Carpe est une glycoprotéine.

B. — Constantes physico-chimiques

1. Poids moléculaire

l.e taux de sédimentation de différentes préparations a été déterminé par ultracentrifugation

en gradient de saccharose. I ne valeur approximative du poids moléculaire peut en être déduite

Tableau VI

Composition en amino-acides de différentes préparations de la glycoprotéine gonadotrope

(nombre de résidus et nombre de résidus pour 100 résidus analysés )

par comparaison avec les protéines standards (lysozyme et pepsinogêne ) dont les poids moléculaires

encadrent celui de la protéine inconnue. I^es résultats sont résumés dans le tableau VIII. Le taux

de sédimentation, comme le poids moléculaire, sont légèrement différents pour les différentes

expériences. Relativement au pepsinogêne. le poids moléculaire de la préparation G 52 est de

33.470 alors que celui des préparations BG 121 et BG 2-116 sont respectivement de 25.000 et

27.100. Ces différences peuvent être dues au degré de pureté plus élevé des préparations BG 2-116

et BG 121 mais il faut se souvenir que la détermination d'un taux de sédimentation n’est faite par

cette méthode qu'avec une certaine imprécision (déviation standard environ 6 %) (Fontaine et

Condliffe, 1964). La détermination de TS a sans doute été meilleure dans le cas de BG 2-116

et BG 121 (centrifugation plus courte, à vitesse plus élevée entraînant une diffusion réduite).

I 561 011 6 3

Source : AANHN, Paris

ÉLISABETH BUHZAWA-LÉKAKD

D’un autre côté, la détermination du poids moléculaire n est valable que si on compare la

substance à étudier à un standard de forme similaire. !\ous avons effectué une autre expérience

en utilisant comme standard une hormone gonadotrope de Mammifère, la LH. qui est aussi une

glycoprotéine et dont on peut penser, comme nous le verrons, qu elle présente des similitudes avec

la glycoprotéine gonadotrope de Carpe, l^es distances parcourues sont respectivement de 2.51 cm

Tableau VII

Composition en glucides de différentes préparations de la glycoprotéine gonadotrope

(g/100 g de protéine)

Type I

Type 1

Hexoses

8,6%

Hexosamines totales

4,9%

Galactosamine

2,2 %

2,7 %

Glucosamine

1,1%

1 . 1 %

Pentose (fucose)

Acide sialique

0,35%

* Le dosage quantitatif n'a pas été réalisé.

** Déterminé par le Dnrleur Robert.

Tableau VIII

Taux de sédimentation et poids moléculaire de différentes préparations de la glycoprotéine

déterminés par ultracentrifugation en gradient de saccharose

PREPARATIONS

tours/mn

distance

parcourue(cm;

taux de

sédimentation

Poids Moléculaire

du Standard

Poids moléculaire

de la glycoprotéine

en fonction du standard

Eip 1

6 52 - type 1

38.000

[21 h ]

0.86

2,9

Pepsinogene

38.000

E21 h 1

1.04

3,4 *

41. 000 *

33.400

Exp II

BG121 - type III

65.000

[15 h 1

2.15

2,44-2.67

Pepsinogene

idem

2.99

3,4

41. 000

25. 000

Lysozyme

idem

1,54

1,91 *

14. 000 *

23.100

Exp III

BG2-116 -type IV

idem

1.62

2,55

Pepsinogene

idem

2.16

3.4

41. 000

27. 100

Eip IV

BG2-154 -typelll

idem

2.57

2,27

LH M2

idem

2,74

2,42 **

29.000 a 30.000**

26.400 a 27.300

* Selon Y.-A. fontaine et P. G. Conduite <1964 i.

** Selon Courte (1970).

pour cette dernière et 2.74 cm pour la LH. D’après Courte (1970). le taux de sédimentation et le

poids moléculaire de la LH sont de 2,42 et 29.000 - 30.000. Pour la glycoprotéine .le Carpe, les

valeurs de ces paramètres seraient donc de 2,30 et 26.000 - 27.000.

Source : MNHN, Paris

HORMONE GONADOTROPE DE LA C.ARPK

2. — Point isoélectrique

La glycoprotéine gonadotrope, par son comportement au cours de la préparation, manifeste

un caractère acide très net et, de plus, nous observons que, placée en tampon citrate-phosphate

pH 5, elle précipite. Son point isoélectrique pHi peut être estimé voisin de 5.

Une détermination plus précise a été réalisée au moyen d’une électrophorèse par isofocalisation.

Celle-ci a été réalisée grâce à l'amabilité du Docteur Reïberotte (Hôpital Broussais).

Le maximum de la courbe représentant l’activité biologique correspond à un pH de 5,1.

Nous n'avons pas retenu l'emploi de cette méthode pour la purification, car la préparation précipite

à son point isoélectrique et une forte perte d’activité biologique se produit alors.

C. — Structure quaternaire

Les résultats obtenus suggéraient une certaine labilité de la glycoprotéine active. L'étude

de l'homogénéité de la préparation la plus pure (type IV), en particulier, suggère qu'une trans¬

formation de cette molécule en une molécule inactive de poids moléculaire moitié moindre a lieu

dans certaines conditions. L'existence d’une structure quaternaire a été recherchée au moyen de

l'action d'agents dissociants. Les transformations qui peuvent se produire ont été étudiées par ultra¬

centrifugation et filtration sur G 1(M). La recherche de l’activité biologique a été conduite

simultanément.

1. — Action de l'urée

a) Sur l'activité biologique

L'activité biologique de la préparation BG 121 (type III) a été recherchée par le test de

spermiation de la Grenouille après traitement de la solution a l'urée 6 M pendant 20 heures à

37 "C. Deux solutions témoins ont été simultanément dosées : la première sans aucun traitement

préalable, la seconde après incubation à 37 U C pendant 20 heures en l’absence d'urée.

Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau IX.

Tableau IX

Influence de l'urée sur l’activité biologique de l'hormone gonadotrope de la Carpe

D 50 ( fig/grenouille )

0 50 (/ig/grenouille)

050 (/ig/grenouille)

Témoin non incubé

Incubation à 37°C ( 20 )

tampon phosphate pH 7.0

Incubation a 37°C (20h)

tampon phosphate pH 7.0

urée 6M

4.1 12.8 - 5.81

9.8 [7,7-12.4]

45.0

L’activité biologique est fortement diminuée après traitement à l'urée. L'incubation à 37 °C

entraîne à elle seule une diminution nette île l'activité gonadotrope mais elle ne permet pas

d'expliquer celle plus importante, observée avec l'urée.

b) Sur l'encombrement moléculaire

L’hormone lutéinisante de Mammifères est dissociée en deux sous-unités par l'urée 8 M ;

celles-ci ne possèdent qu'une activité biologique très réduite (environ 10 % de celle de la molécule

Source : MNHN, Paris

ÉLISABETH BI K/AWA-(.KKAUI)

colonne 0,7 x 70 cm

tampon Tris phosphate pH 7,1

A BG 121 (type III)

B BG 121 (type III) préalablement incubé 24 h dans l'urée 8M.

O—O Protéines (densité optique D.O. 276 mu)

•—•Conductivité m MHO

native) (de la Llosa et al., 1967). Il pouvait en être de même pour la glycoprotéine gonadotrope

de Carpe. Nous avons recherché au moyen de tests biochimiques si l’urée ne produisait pas une

dissociation de cette molécule.

La préparation BG 121 (type III) est incubée dans l'urée 8 M à 25 “C pendant 24 heures

puis filtrée sur Sephadex G KM) en tampon Tris-phosphate pH 7,1. La même préparation (sans

traitement à l’urée) est filtrée sur Sephadex G 1(M) dans les mêmes conditions.

Source : MNHN, Paris

HORMONE GONADOTROPE DE I.A CARPE

Les résultats sont représentés ligure 13. La filtration témoin conduit à l'exclusion d’un pic

(K d - 0.32) qui correspond à celui déterminé pour la glycoprotéine gonadotrope. La filtration du

produit incubé conduit à l'élution de deux pics d'importance différente. Le premier, dont le

coefficient d'exclusion k D - 0.04. très voisin du zéro, correspond à des protéines de poids molé¬

culaire supérieur à 70.000. Cette fraction représente environ 10 % du matériel de départ. Le

deuxième pic est élué pour un coefficient d’exclusion K D = 0.32, c'est-à-dire celui de la molécule

native.

2. — Effet <ht changement de pli

n) Sur l'activité biologique

L'activité biologique des différentes préparations gonadotropes a été généralement recherchée

dans une solution de NaCl (0,1 M) et de pH 7.4. Nous avons recherché ce qu'elle devenait après

incubation pendant une heure à la température ambiante à dçs pH variables, la molarité étant

toujours égale à 0.1 M. Cette étude a été réalisée sur la préparation BG 2-154 (type III). L'activité

biologique est fortement diminuée lorsque le pH devient égal ou inférieur à 5 (fig. 14).

D 50(|ig /grenouille)

24.

22 .

14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 pH

Figure 14

Variation de la dose moyenne effective (D50) de la préparation gonado¬

trope BG2-154 (type III) en fonction du pH.

D,jqÎ erreur type de la moyenne

tampon phosphate (0,1M) de pH9 à pH5.

tampon glycine-HCl (0,1M) pour les pH les plus acides.

b) Sur l'encombrement moléculaire

L'expérience a été réalisée en utilisant trois tampons de pH différents (2,2 - 7,4 - 10,6)

mais ayant même molarité (0.1 M). La préparation BG 2-67 (type IV) a été utilisée (500 pg sont

dissous, incubés pendant une heure à la température ambiante et soumis à une ultracentrifugation

Source : MNHN, Paris

ÉLISABETH BUR7.AWA-GÉRARD

D.0. 750 m|i

Ultracentrifugation de la préparation BG 2-67 (type IV) à

différents pH.

15 h à 65.000 t/mn centrifugeuse Spipco Modèle

L/L2 Rotor SW 65.

tampon pH 2,2 (HCl 0,1M-KC1 0,1M)

tampon pH 7,4 (phosphate de sodium-NaCl 0,1M)

tampon pH 10,6 (Na-OH 0,lM-glycine 0,1M)

Protéines (densité optique D.O. 750 mu

après réaction de Lowry-Folin.

Source : MNHN, Paris

HORMONE OON/

PE DE I.A CARPE

en gradient de saccharose dans le tampon considéré). Le taux de sédimentation a été déterminé

pour chaque échantillon. Les résultats sont représentés figure 15. Le taux de sédimentation à pH 7,4

ou à pH 10,6 est de 2,5 - 2,7 mais il est de 1.75 à pH 2.2. Le diagramme d'élution îles protéines

centrifugées à pH 2,2 n’est pas symétrique. L’existence de protéines ayant encore le taux de sédi¬

mentation de l’hormone native doit être à l’origine de cette dissymétrie.

L’activité biologique est. comme nous venons de le voir, fortement diminuée mais non

totalement disparue à pH 2,6 : par contre, il semble bien que cette activité n’est pas modifiée

à pH 9 - 10 (cf. purification). Ceci suggère que seules les protéines de taux de sédimentation égal

à 2,5 - 2,7 possèdent l'activité biologique.

Ces résultats indiquent l’existence, à pH fortement acide, d'un changement dans la confor¬

mation de la molécule. Il s'accompagnerait d’une variation dans le poids moléculaire. Une telle

variation peut traduire une dissociation de la molécule en deux sous-unités.

3. — Action de l'acide propionique M

Nous avons recherché également l’action de l’acide propionique M sur nos préparations. Cet

acide est utilisé par Liao et Piehcf. (1970) pour la b-TSH et par Papkoff et Ekblad (1970) pour

la o-FSH afin de séparer les deux sous-unités de ces glycoprotéines hormonales.

a) Influence sur l'activité biologique

Après incubation de BG 2-154 (type III) dans l’acide propionique M pendant 15 heures à

température ambiante, la D 50 passe de 5.6 (4.2 - 8.0) pg à 20,1 (15,6 - 26.9) pg.

b) Influence sur l’encombrement moléculaire

Nous l'avons recherché au moyen de la technique d’ultracentrifugation en gradient de sac¬

charose. Trois préparations ont été utilisées simultanément : la préparation gonadotrope de la

Carpe BG2-154 (type III), la FSH-M 2 (C.N.R.S.) qui dans ces conditions est dissociée et la pré¬

paration BG 2-69 qui est la fraction inactive (Rf = 0.80) obtenue après électrophorèse préparative.

Cette dernière est, comme nous le verrons, une protéine homogène dont les caractéristiques en

ultracentrifugation sont connues (TS =1.81 - PM = 15.800). bille sera considérée ici comme

standard. Le gradient de saccharose est établi en milieu propionique M et les différentes

préparations, après avoir été placées 15 heures dans l’acide propionique M, sont centrifugées

15 heures à 65.000 tr mn. Les taux de sédimentation sont alors déterminés en fonction de la

protéine standard. Ils sont égaux à 1.65 pour la glycoprotéine de la Carpe BG 2-154 et à 1,55

pour la FSH-M 2 (C.N.R.S.).

La FSH dans ces conditions est, on le sait, dissociée en ses deux sous-unités (le taux de

sédimentation mesuré correspond effectivement à un poids moléculaire de 13.500 environ).

La glycoprotéine de Carpe manifeste un comportement semblable. Le maximum île la courbe

des protéines est obtenu pour une valeur de 1.65 du taux de sédimentation correspondant à un

poids moléculaire d’environ 15.800. Ceci suggère que. comme dans le cas de la FSH. une

dissociation de la molécule native a lieu avec libération des sous-unités de poids moléculaire

moitié moindre. La protéine de référence qui est ici la préparation BG 2-69 (cf. tableau X)

manifeste le même comportement au cours de l'ultracentrifugation à pH 7,4 et en milieu propio¬

nique M. La distance parcourue par le pic n’est pas très différente lors des lieux expérimentations.

4. — Essai de réassociation

Chez les Mammifères, les hormones glycoprotéiques dissociées peuvent être réassociées et

retrouver les caractéristiques biologiques et biochimiques de l'hormone native (de la Llosa et al.,

1967, Pierce et al. 1970, Papkoff et Ekblad. 1970).

Source : MNHN, Paris

ÉLISABETH BURZAW A-liÉRARD

En ce qui concerne la glycoprotéine gonadotrope de la Carpe, les conditions de réassociation

décrites pour les Mammifères ne sont pas satisfaisantes. En effet, la seule incubation de l'hormone

native à 37 °C produit une perte importante de l'activité biologique. Des résultats positifs ont

toutefois été obtenus par simple élimination de l’agent de dissociation.

a) Nous avons observé que l’hormone traitée à l'acide propionique M, puis lyophilisée et

redissoute à pH 7,4 retrouve le même taux de sédimentation que la molécule native (2,50 au lieu

de 2,54).

b) Les résultats sont moins nets en ce qui concerne la réapparition de l’activité biologique.

La D 50 de la solution traitée puis lyophilisée diminue, mais seulement de 20 à 15 |Ag. L’hypothèse

de l’existence d'une structure quaternaire de la glycoprotéine purifiée, que nous avions formulée

précédemment, peut être considérée favorablement. Cependant, les conditions optimales de restau¬

ration de l’activité par réassociation des sous-unités devront être recherchées.

5. — Propriétés de la fraction (.4 ) obtenue après /'électrophorèse préparative

Au cours de l'électrophorèse préparative, une fraction (A) (Rf = 0.80) est séparée des pro¬

téines possédant l’activité biologique. Certaines de ses caractéristiques biochimiques ont été recherchées

et sont résumées dans le tableau X. La fraction (A) présente les caractéristiques d’une protéine

Tableau X

Comparaison des constantes biochimiques et de l'activité biologique

de la glycoprotéine hormonale et de la fraction (A)

METHODES

FILTRATION sur

SEPHADEX G100

ULTRA

CENTRIFUGATION

ELECTROPHORESE

ANALYTIQUE

ACTIVITE

BIOLOGIQUE

[test de spermiation

de la grenouille!

CONSTANTES

k d

Rayon de

Stokes r [Kl

P. M.

pH i

D50 (yig/grenouille)

c-GTH

0.28

(0,26-

0,32)

31,3

2.57

27.000

5,1

0,50-0,54

5,0

c-GTH

pH 2.2

1,7

15.400

grd. Nomb.

de bandes

uree 8M

0,32

30.8

îî,nr

1,6

13.800

FRACTION (Al

0.40

[0.38-

0.42]

24,6

1,8

15.800

4,4

0,80

>100

homogène, I^es diagrammes obtenus sur Sephadex et ultracentrifugation sont symétriques. Une

seule bande est présente sur les gels analytiques d’électrophorèse sur polyacrvlamide dans les

conditions où nous 1 employons. Le coefficient d'exclusion sur Sephadex G 100 est 0,42, le rayon

Source : MNHN, Paris

HORMONK (.ONADOTROPK l)K I.,'

de Stokes est de 24,6 Â. Le taux de sédimentation, déterminé par ultracentrifugation en gradient

de saccharose est de 1,8 (relativement au pepsinogène) correspondant à un poids moléculaire

de 15.800.

Ces données ont été comparées dans le tableau \ à celles obtenues pour la glycoprotéine

native ou traitée par divers agents chimiques. Nous observons ainsi que certaines données (poids

moléculaire et TS) peuvent être rapprochées de celles définies pour la glycoprotéine traitée par

des agents dissociants.

Nous avons également comparé la composition en acides aminés de la glycoprotéine gona¬

dotrope et de la fraction (A). Les analyses ont été réalisées pour trois temps d'hydrolyse 24. 48

et 72 heures et la concentration de chaque acide aminé a été extrapolée â sa valeur maximale.

Les résultats sont représentés graphiquement (lig. 16). Nous avons exprimé ici le nombre de

résidus [tour 100 résidus analysés, de sorte que si les deux préparations possédaient la même

composition, aucune variation ne serait observée. Des différences apparaissent pour certains

acides aminés : la lysine, la cystine. l'alanine, la tyrosine et la phénvlalanine sont moins abon¬

dantes dans la fraction (A) tandis que l’acide glutamique, la proline et la thréonine y sont présents

Comparaison de la composition en acides aminés (exprimés en

résidus/100 résidus entre la fraction (A) et la préparation

BG 2-67 (type IV)

- BG 2-68

-Fraction (A)

■ ....iM, Différence entre les deux valeurs des concentrations

MM pour un acide aminé.

Source : MNHN, Paris

ÉLISABETH BURZAWA-LÉHAKD

«*ii plus grand nombre. D'autres différences existent «nais elles sont moins importantes et peuvent

être imputées à l'erreur expérimentale. L'ensemble «le ces résultats pourrait s’expliquer en

supposant, que la fraction (A) représente l’une des «leux sous-unités vraisemblablement présentes

après traitement «le la glv«-oprotéine active par l’acide propionique M ou à pH acide.

D. — Résumé

Le matériel gonadotrope purifié à partir de l’hypophyse de la Carpe est une glycoprotéine

dont la composition a été déterminée. Son poids moléculaire est d'environ 27.000 et son point

isoélectrique voisin de 5. Nous avons étudié l’effet de divers agents dissociants sur cette glyco¬

protéine (urée. pH acide, acide propionique M) sur l’activité biologique et l’encombrement

moléculaire. L'urée 8 M entraîne une perte importante «le l'activité biologique sans «lissociation de

la molécule ou avec une dissociation facilement réversible. En présence d'acide propionique M

ou à des pH de l’ordre de 2, l'activité biologique est très diminuée et il apparaît un matériel de

poids moléculaire voisin de 16.000. ce qui suggère une «lissociation de la protéine native. Enfin,

nous avons étudié les caractéristiques biochimiques de la fraction (A) inactive dérivant de la

glycoprotéine gonadotrope. Cette fraction apparait similaire par son taux de sédimentation à la

protéine dissociée. Sa composition en amino-acides n'est pas identique à celle de la glycoprotéine

hormonale. Elle pourrait représenter une des sous-unités de la molécule native.

V. — COMPARAISON BIOCHIMIQU E ENTRE LES HORMONES GONADOTROPES LH

ET FSH DE MAMMIFERES ET L'HORMONE GONADOTROPE DE LA CARPE

La glycoprotéine que nous avons purifiée manifeste, comme nous le verrons au chapitre

suivant, toutes les caractéristiques de l'hormone gonadotrope de Carpe et sera désignée par

l’abréviation c-GTH.

A. — Composition chimique

1. — Acides aminés

La comparaison de la composition globale en acides aminés est résumée dans la figure 17.

Nous avons représenté ici le rapport des concentrations «le chaque acide aminé pour divers

couples d'hormones. La courbe qui est obtenue en joignant les «lifférentes valeurs donne un profil

des «lifférences existantes. Avec les données bibliographiques concernant les LH ovine et bovine, une

courbe témoin (courbe I) peut être tracée. En effet, nous observons que celle-ci est très voisine de

la droite horizontale d’ordonnée égale à l'unité. Des différences pour la cystine et la valine sont

cepenilant mises en évidence mais la valeur de la concentration de ces amino-acides peut être

sous-estimée : la cystine est très fragile en milieu chlorhydrique 6 M et la valine nécessite des

temps d’hydrolyse très longs pour être libérée totalement.

La courbe II représente les différences observées entre l’hormone gonadotrope de la Carpe

et la LH de Bœuf ou de Mouton. Des différences importantes et «pii intéressent de nombreux

acides aminés sont mises en évidence. Elles ne peuvent être dues à des différences de conditions

d’hydrolyse car elles concernent en particulier des acides aminés dont la destruction au cours de

celle-ci est peu importante. Par contre, six amino-acides sont présents à une concentration très

voisine : la lysine, la thréonine, la sérine, l’isoleucine. la leucine et la phénvlalanine.

La même comparaison (courbe III) a été réalisée avec la o-FSH. Des différences existent

également qui sont très importantes : la proline, la méthionine, la tyrosine et surtout la valine

sont plus abondantes dans la c-GTH.

L’alanine et la phénvlalanine sont par contre beaucoup moins abondantes dans l'hormone

gonadotrope de la Carpe que dans la FSH ovine. Mais les concentrations de l’histidine, de l'argi¬

nine, de l’acide aspartique, «le la thréonine, «le la sérine, «le l’isoleucine et de la leucine sont

très voisines.

Source : MNHN, Paris

Lys His Arg Asp Thr Ser Glu Pro Gly AlaJysVal Met Ile Leu Tyr Phe

Variation du rapport des concentrations de chaque araino acide des

hormones LH et FSH des Mammifères et deic-GTH.

Courbe I •-« c (A.A.) de o-LH selon Ward et al. (1969)

c (A.A.) de o-LH selon de la LLosa et al. (1968)

O-O c (A.A.) de b-LH selon Ward et al. (1969)

c (A.A.) de b-LH selon Reichert et al. fl969)

Courbe II 9 » c (A. A.) de c-GTH _

c (A. A.) de à-LH selon Ward et al. (1969)

q...O c (A. A. ) de c-GTH _

c (A.A.) de b-LH selon Reichert et al. (1969)

C ourbe III c _« c (A. A. ) de c-GTH _

c (A.A.) de o-FSH selon Papkoff et al. (1970)

Source : MNHN, Paris

ELISABETH

K/A\VA-(.ÉKAI<U

Dans l’hypothèse où la fraction (A) représenterait bien l’une des sous-unités «le l'hormone

native, une comparaison entre cette fraction (A) et la c-G1 H et les sous-unités des hormones o-LH

et o-FSH a été entreprise. Les données ont été rassemblées dans le tableau XI.

Aucune analogie n’apparaît, la composition de la fraction (A) est différente de celle des

diverses sous-unités des hormones de Mammifères, il en est de même pour la différence entre les

compositions de l'hormone gonadotrope de la Carpe et de la fraction (A). Cette différence pourrait

correspondre à la composition de l’éventuelle seconde sous-unité.

Tableai XI

Comparaison de la composition en amino-acides (résidus pour 1011 résidus analysés )

des sous-unités des hormones o-LH et o-FSH avec la fraction inactive (A)

et l'hormone çonndotrope de C.nrpe

Amino- acides

o-LH*

0- FSH*

c-GTH

R/100 R

tac

c-GTH

c-GTH - [Al

LYS

9,6

1,9

10,5

7,8

4,5

6,7

8,6

HIS

2,9

2,8

3,2

3,1

3,4

3,2

2,7

ARG

2,9

6,6

4,5

4,6

3,7

4,1

4,3

ASP

6,7

4,7

11,2

10,0

8,2

8,4

7,8

THR

9,6

4,7

6,2

9,5

8,6

1,7

6,1

SER

5,8

4,7

5,7

7.5

5,6

6,8

7,6

6 LU

9,6

5,7

12,6

11,0

11,4

9,2

6,1

PRO

7,7

18,9

5,6

6,7

12,9

8,3

2,6

GLY

4,8

5,7

4,7

4,9

4,0

3,9

ALA

7,7

6,6

8,3

2,5

4,9

1/2 CYS

9,6

9,4

4,9

8,0

2,8

6,9

10,6

VAL

5,8

7,6

5,5

6,3

11,8

11,5

10,3

NET

3,9

1,9

0,3

0.8

1,5

2,2

ILE

1,9

3,8

2,7

3,6

2,6

2,8

LEU

1,9

11,3

9,0

4,8

8,1

7,4

6,1

TYR

4,8

0,9

2,7

3,8

3,0

4,8

6,3

PHE

4,8

2,8

4,2

3,8

1,5

2,8

3,8

* Selon PapkolT et Ekiilad 1197(11.

2. — Glucides

La comparaison entre les parties glvcaniques des différentes hormones gonadotropes mettent

également en évidence des différences.

La concentration en hexoses et en hexosamines est différente à la fois de celle des deux

hormones gonadotropes des Mammifères (Birzawa-Gérard. 1969).

B. — Constantes physico-chimiques

Nous avons résumé dans le tableau XII les données qui concernent l'hormone gonadotrope

de la Carpe ; elles ont été comparées à celles relevées dans la littérature pour la LH et la FSH

de Mouton.

Source : MNHN, Paris

HORMONE GONADOTROPE UK I

Tableau XII

Constantes physico-chimiques de c-GTH et de la fraction (A)

ainsi que celles concernant les hormones LH et FSH et leurs sous-unités

Constantes physico - chimiques

c-GTH

fraction

[Al

o - LH*

“ -LH

P-LH

o-FSH*

œ -FSH

P-FSH

Taux de Sédimentation

2,5

1,8

2,42

' î

5Î^

Poids Moléculaire

29.000

15.800

29.000

30.000

«=14.000

28.000

30 a 000

15.000 a 17.000

Coefficient d'exclusion

0,28

0,40

0,30

0.45

0,45

0,30

'0,401 0.5d

Rayon de Stokes

31,3

24,0

30 i 1

24 il

24 ±1

Point isolelectrique

5,1

4.4

7,3-77

4,5

• Selon Courte 11970t.

** Selon Papkoff et Ekl.lud 119701.

L analyse de re tableau montre que nous sommes en présence d'une glycoprotéine de poids

moléculaire et d'encombrement stérique très voisins de ceux qui caractérisent les glycoprotéines

gonadotropes chez les Mammifères.

De même ces paramètres ont des valeurs voisines pour la fraction (A) et pour les sous-unités

des hormones gonadotropes de Mammifères.

C. — Effets des agents dissociants

L'urée 8 M dissocie la LH. la filtration sur Sephadex G 100 qui suit l'incubation dans l'urée

donne un pic d'élution exclu [tour K D - 0.45 alors que celui de l'hormone native est «le 0.30.

Incubée dans l'urée puis filtrée sur Sephadex G 100. l’hormone gonadotrope de la Carpe ne

présente pas la même caractéristique : 10 des protéines forment un agrégat de poids molé¬

culaire élevé, le reste des protéines est exclu sans variation du coefficient d’exclusion. Par contre,

les expériences réalisées en milieu acide (tampon pH 2.2 [0.1 M] ou acide propionique M) ont montré

que l’hormone gonadotrope de la Carpe manifestait le même comportement que la LH ou la FSH.

D. — Conclusion

Nous avons comparé les propriétés physico-chimiques et la composition des hormones gona¬

dotropes LH et FSH de l'hypophyse des Mammifères avec celles de l'hormone gonadotrope de la

Carpe. Ces hormones présentent de nombreuses analogies : ce sont toutes des glycoprotéines

d'encombrement moléculaire voisin, elles possèdent toutes une structure quaternaire. Toutefois,

elles sont différentes par leur composition en amino-acides et en sucres.

VI. — DISCUSSION

A. — Préparation

La méthode de purification que nous avons mise au point conduit à la séparation d’une

fraction d'activité spécifique élevée (1,5 I en terme de LH-.NIH-S 1) avec un rendement en

protéines de 0.35 à 0.50 et un rendement en activité de 15 à 30 %. La chromatographie sur

DEAKC est l'étape au cours de laquelle le rendement est le moins satisfaisant (50 à 70 % selon

Source : MNHN, Paris

ÉLISABETH Bl IIZAWA-GF.HAI

les cas) : de plus, la séparation des activités thyréotrope et gonadotrope est incomplète et nous

conservons pour les étapes ultérieures une partie seulement des protéines possédant I activité

gonadotrope (35 à 40 de l'activité initiale).

Donaldson et Yamazaki (1968 a) purifient l'activité gonadotrope de l'hypophyse du Saumon

Oncorhynchus Ishawylscha par deux filtrations successives sur Sephadex G 100 et éventuellement

une chromatographie sur DEAEC.

Sinha (1969-1971 ) réalise une filtration sur Sephadex G 100 d'un extrait hypophysaire de

Carpe. Il étudie l'activité biologique des trois fractions qu'il sépare en recherchant leur action

sur la spermiation de la Carpe. Seule la fraction II. retardée sur G 100. donne des réponses

positives.

Breton (1968) décrit la purification d'une fraction gonadotrope de Gardon à l'aide de

la méthode appliquée par Hkkmiek (1965) pour la préparation d'une FSH de Mouton. 1.'activité

biologique est étudiée à l'aide de différents tests de l'activité gonadotrope des \ ertébrés infé¬

rieurs : elle est retrouvée dans la fraction correspondant à la FSH de Mouton avec un rendement

en activité très faible. Breton obtient un résultat plus satisfaisant par une simple filtration sur

Sephadex G 100 de la poudre hypophysaire brute de Gardon.

La comparaison des activités spécifiques des préparations obtenues par différents auteurs

est difficile. En effet, les receveurs, les méthodes de dosage et les standards sont différents. Yamazaki

et Donaldson ont utilisé pour suivre la purification de l'hormone gonadotrope d'Oncorhynchus, le

test de spermiation du Cyprin hypophvsectomisé (Yamazaki et Donaldson. 1968 a). L’hormone

standard utilisée est l'hormone chorionique humaine : 10 I I donnent une réponse comparable à

celle obtenue pour 3 pg de la préparation gonadotrope d'Oncorhynchus. L'activité spécifique est

alors voisine de 3 III HCG, pg. Nous avons essayé d’exprimer l’activité spécifique île notre

préparation dans la même unité, en sachant que 1 |xg LH-.NIH-S 1 donne la même réponse sur

le test de spermiation de la Grenouille, que 1.25 I I HCG |ig, la préparation d’Oncorhynchus

apparaît alors légèrement plus active que celle de la Carpe. Cette comparaison est en fa il très

artificielle car il semble bien que les Amphibiens répondent beaucoup mieux que les Poissons

Téléostéens aux hormones gonadotropes de Mammifères. Estimée en terme de HCG. une même

préparation d'hvpophvse de Poisson apparaîtra donc moins active si elle est dosée sur un

Amphibien.

Les actions de c-GTH et de onc-GTH sur l'adényl-cyclase de l'ovaire de Cyprin ont été

comparées : c-GTH apparaît 36 fois plus actif que onc-GTH. Cette valeur peut être surévaluée

étant donné que le receveur est un Cvprinidé comme la Carpe (Y.-A. Fontaine et al.. 1972). Ces

exemples montrent que la comparaison des activités spécifiques d'hormones d'espèces différentes

est rendue difficile en raison des phénomènes île spécificité zoologique sur lesquels nous reviendrons.

B. — Degré de pi reté et structure quaternaire

La préparation obtenue après électrophorèse préparative contient, d'une part des protéines

biologiquement actives et. d'autre part une protéine inactive plus électronégative. En ce qui

concerne les premières, elles donnent en électrophorèse analytique une zone de Rf 0.50 à 0.54.

Ceci pourrait être dû à la présence de plusieurs protéines différentes ayant des propriétés électro¬

phorétiques voisines : toutefois, l'ensemble de nos résultats (biochimiques et immunologiques en

particulier) indique que ce fait traduit plutôt une microhétérogénéité à l'intérieur d'un seul type

de molécule glycoprotéique. Une situation similaire a été mise en évidence dans le cas des

différentes hormones glycoprotéiques des Mammifères : la TSH par exemple (PiERCE et al., 1958 ;

Condliffe et al., 1960), la LH (Jutisz et Squire, 1958: Courte. 1970). Quant à la fraction (A)

inactive, nos résultats indiquent qu’elle provient d'une transformation de la glycoprotéine native.

Elle possède un poids moléculaire de 16.000 environ et ne manifeste sur le test de spermiation

de la Grenouille aucune activité biologique. La dissociation de la c-GTH pourrait se produire

Source : MNHN, Paris

HORMONE OONADOTROPE

pendant l'électrophorèse : Ornstf.IN (1964) évoque cette possibilité sous l'influence de la différence

de potentiel élevée qui existe au moment du passage dans le gel de concentration, une dissociation

de certaines protéines enzymatiques ou hormonales peut se produire. Lewis et al. (1968) ont

montré que la prolactine et l'hormone «le croissance donnaient par l'analyse sur gel de polva-

crylamide «les images similaires à celles observées pour la c-GTH. Cependant, nos résultats suggèrent

qu'une dissociation limitée se produit aussi au cours des diverses autres manipulations et de même

au cours «le la conservation. Brrr et Lynch (1972) observent pour la h-FSH «les résultats simi¬

laires. l,eur préparation «le h-FSH présente toujours en proportions variables «les molécules

dissociées.

l-es hormones glycoprotéiques de Mammifères possèdent une structure quaternaire. LlAO et

Piekck (1970) pour la b-TSH. Papkoff et Samy (1967) et «le la Llosa et al. (1967-1968) pour

la o-LH. Papkoff et Kkbi.ad (1970) pour la o-FSH ont dissocié et séparé les sous-unités de

ces trois hormones glycoprotéiques.

La glycoprotéine de la Carpe possède également cette propriété de structure. L'acide pro-

pionique M. le pH acide dissocient la molécule : l'activité biologique est fortement diminuée et

l'encombrement moléculaire devient celui il'une molécule de poiils moléculaire d'environ 15.000.

Cependant, les caractéristiques de réassociation semblent différentes île celles décrites pour les

glycoprotéines mammaliennes et la restauration de l'activité biologique semble plus difficile.

L'identification des sous-unités de l'hormone gonadotrope de la Carpe reste encore impré¬

cise. Nous avons émis l'hypothèse que l'une d'entre elles pourrait être représentée par la fraction (A).

Néanmoins, «les expériences complémentaires devront être faites pour vérifier cette hypothèse.

C. — Comparaison avec les hormones LH et FSH des Mammifères

L'hormone gonadotrope de la Carpe est. comme les hormones gonadotropes des Mammifères,

une glycoprotéine. L'encombrement moléculaire est «lu même ordre et l'existence d'une structure

quaternaire complète les points communs qui existent entre ces «lifférentes hormones.

La composition en acides aminés comme en sucres et en sucres aminés distingue nettement

ces «lifférentes protéines. Aucune analogie n'a également été retrouvée en comparant les sous-unités

de ces diverses hormones.

Insistons sur le fait que cette hormone d'un Poisson Téléostéen ne peut être associée plus

spécialement, ni au groupe des hormones lutéinisantes, ni à celui «les hormones folliculostimulantes

des Mammifères. La ilétermination «les séquences des acides aminés permettra sans doute. île mettre

en éviilence des tronçons communs et «le démontrer l'existence, entre les hormones gonadotropes

des différents Vertébrés, d'une homologie que certaines similituiles chimiques ainsi que des résultats

indirects suggèrent, comme nous le verrons plus loin.

Source : MNHN, Paris

CHAPITRE II

CARACTERISATION BIOLOGIQUE DE L'HORMONE GONADOTROPE

DE LA CARPE

COMPARAISON AVEC LES HORMONES GONADOTROPES DES MAMMIFERES

I. — INTRODUCTION

La purification et la caractérisation chimique d'une glycoprotéine présente dans Thypophvse

de la Carpe et active sur la spermiation de la Grenouille ont été étudiées au cours du chapitre

précédent. L'utilisation de ce seul test ne peut permettre l'identification de la nature hormonale

et de la fonction gonadotrope de cette préparation.

Nous l'avons recherchée par l'étude de l'effet de cette glycoprotéine chez le Cyprin hvpo-

phvsectomisé. Nous avons étudié, d'une part chez le mâle, la spermatogénèse et la spermiation

et d'autre part chez la femelle, la vitellogénèse et l'ovulation. Un examen histologique a été

réalisé sur la gonade des animaux.

De plus, nous étudierons l'action de la glycoprotéine sur divers paramètres biochimiques

de l'activité gonadique chez le Cyprin ou l'Anguille. Ces études nous conduiront à conclure que

la glycoprotéine purifiée est l'hormone gonadotrope de la Carpe (c-GTH).

L'utilisation au cours de la purification du seul test de spermiation île la Grenouille ne

nous permet pas d'exclure l'existence d'une deuxième fraction inactive sur ce test mais qui aurait

une action sur la gonade des Poissons. Afin de répondre à cette question, nous avons étudié le

„ ... c-GTH

rapport d activité —------ sur différents tests de l'activité gonadotrope chez les Ver-

hvpophvse de Carpe

tébrés inférieurs. Si ce rapport reste constant, on est conduit à conclure qu'il i

l’hypophvse d'autre substance gonadotrope que celle que nous avons purifiée.

pas dans

Dans une troisième partie, nous chercherons à comparer les caractéristiques biologiques des

hormones gonadotropes des Vertébrés supérieurs et celle de l'hormone gonadotrope de la Carpe.

Nous étudierons, d'une part l'action de nos préparations par les tests classiques utilisés pour le

dosage des FSH et des LH de Mammifères (Steelman et PoHLEY, 1953 : Paklow. 1961) et d'autre

part l'action des hormones LH et FSH par les tests de l'activité gonadotrope utilisant îles Vertébrés

inférieurs comme receveurs.

IL — ACTION DK LA c-GTH SUR LA GONADE DE POISSONS TELBOSTEENS :

NATURE HORMONALE DE c-GTH

L'activité hormonale se caractérise essentiellement par la réponse de l'effecteur. De plus.

Sutherland et al. (1968) ont précisé l'intermédiaire par lequel certaines hormones agissent sur

les cellules effectrices. Chez les Mammifères, les hormones gonadotropes en particulier exercent

au moins une partie de leur action en stimulant une adénvl-cvclase (Marsh. 1970 : Kuelh et al.,

1970 ; Fontaine et al., 1971 : Kolena et Channinc. 1972).

Source : MNHN, Paris

HORMONE (.ON

ITRORE

CARPE

A. — Régénération df. la gonade di Cyprin hypophysectomisé

Les Cyprins sont hypophysectomisés par voie opercuiaire selon Chavin (1956) et sont gardés

à 20 °C pendant un mois avant tout traitement hormonal. Dans ces conditions, les gonades sont

complètement régressées, seules subsistent les ovogonies ou les spermatogonies souches ; d'éventuels

spermatozoïdes résiduels non éjaculés ont eux-mêmes complètement disparu. Chez les femelles, les

ovocytes primaires représentent la forme la plus évoluée et aucune amorce de vitellogénèse ne peut

être observée. Ces résultats (Billard et al., 1970) sont en accord avec ceux précédemment décrits

(Yamazaki, 1965). Les Poissons reçoivent alors par voie intra-péritonéale trois injections par

semaine de la solution hormonale (0,1-1-5 pgg de poids et par injection) de la préparation

BG 2-67 (type IV) ou d'un extrait hypophysaire brut d'hypophvses de Carpe (5 jjtg/g de poids et par

injection). Les animaux témoins, hypophvseetoniisés ou non. reçoivent des injections de

sérum physiologique. Les Poissons ont été sacrifiés en moyenne entre les 50' et 70' jours après

le commencement des injections.

1. — Résultats obtenus sur la gonade mâle

Après 41 jours de traitement, les animaux mâles recevant la forte dose d'hormone sont

capable d'émettre du sperme après légère pression de l'abdomen alors que les animaux témoins

hypophysectomisés et non hypophysectomisés ne peuvent le faire. Ce résultat indique que la

c-GTH exerce son action sur la spermatogénèse et sur la spermiation. Ce premier point est confirmé

par la mesure du RGS et par l'examen histologique.

a) Le RGS, qui est égal à 0,9 chez les animaux témoins hypophysectomisés, passe à 2 chez

les animaux hypophysectomisés traités par la c-GTH.

b) L’histologie a permis l’obtention de données quantitatives plus précises. Le nombre de

cellules de la lignée spermatogénétique par unité de volume a été déterminé au moyen d'un oculaire

intégrateur. L’histologie du testicule des Poissons hypophysectomisés confirme la dégénérescence

de la gonade : seules subsistent les spermatogonies et les cellules de Sertoli, la lumière des tubules

reste cependant individualisée.

Les effets de la c-GTH sur l’aspect histologique du testicule sont représentés graphiquement

figure 18. La spermatogénèse est fortement stimulée : les spermatogonies B en particulier, les

spermatocytes, les spermatides et les spermatozoïdes augmentent de façon spectaculaire par rapport

aux mêmes cellules chez les animaux témoins hypophysectomisés. La dose la plus efficace est celle

de 1 |Ag/g. Les phénomènes de picnose sont beaucoup plus élevés chez les Poissons qui reçoivent

la forte dose, en conséquence la production en spermatozoïdes se trouve diminuée.

Les effets de l’extrait salin hypophysaire de Carpe ont été également étudiés ; la spermato¬

génèse des Poissons hypophysectomisés recevant l’équivalent de 5 (ig d’hypophyses de Carpe par

injection et par gramme de poids corporel est restaurée. Le nombre de cellules comptées, par unité

de volume, de chaque espèce cellulaire de la lignée spermatogénétique. est très voisin de celui

des animaux témoins non hypophysectomisés (il est aussi légèrement inférieur à celui des

animaux qui reçoivent 0,1 p,g de la c-GTH g et par injection). Dans ce lot également, le

nombre de cellules picnotiques est plus élevé que dans le lot des témoins non hypophysectomisés.

2. — Résultats obtenus sur la gonade femelle

L’expérimentation sur les Poissons femelles a été poursuivie parallèlement à celle sur les

mâles et dans les mêmes conditions expérimentales. Les animaux sont sacrifiés après un traitement

de durée variable (20 à 70 jours). Les effets de l'hormone purifiée sont résumés dans le tableau XIII.

a) Après hypophysectomie, le RGS diminue, il passe de 4 environ à des valeurs de l’ordre

de 2. Après traitement à la c-GTH. l’augmentation du RGS n’est pas très élevée : les Poissons

qui reçoivent 0,1 jig de c-CTH/g de poids et par injection ont un RGS d'environ 3 ;

ceux qui reçoivent une dose dix fois plus élevée retrouvent en moyenne le RGS qu’ils possédaient

4 564 Ull 6 »

Source : MNHN, Paris

Sertoli

H 5

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C" I 1

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Figure 19

Ovaire de Cyprin hvpophvsectomisé témoin.

Coloration hémalin éosine G x 80.

Ovaire de Cyprin hvpophvsectomisé recevant .ïpg/g/in-

jection de la préparation BG2-67 (type IV).

Coloration hémalin éosine G x 80.

Figure 20

Ovaire de Cyprin hvpophvsectomisé recevant O.lp^in-

jection de la préparation BG2-67 (type IV).

Coloration hémalin éosine G x 80.

Figure 22

Ovaire de Cyprin hvpophvsectomisé recevant 5pg/g^in-

jection de la préparation BG2-67 (type IV). Ovogonie

en cours de multiplication.

G x 360 Col. hémalin éosine.

Figure 23

Ovaire de Cyprin hvpophvsectomisé recevant 5|lg/g/in-

jection de la préparation BG2-67 (type IV).

Cellules folliculaires et de la thè<|ue

G x 360 Col. T.

Source : MNHN, Paris

HORMONE «iONADOTHOPE UE LA C/

avant l'hypophysectomie. Une très forte augmentation est observée, pour un Poisson, dont le RGS

passe à 11. Cet animal avait reçu pendant 70 jours des doses d'hormone plus importantes, soit

5 pg/g *le poids e * P ar injection. Notons que la valeur maximale du RGS observée chez les

Cyprins vivants dans la nature est. selon Yamazaki (1965). île l’ordre 12.

b) l/étude histologique des ovaires a permis «l'obtenir des résultats plus intéressants. Les

Poissons témoins hypophvsectomisés présentent un ovaire analogue à celui décrit pour les Poissons

immatures : les ovocytes ont un diamètre de 75 à 140 p ; ils se maintiennent aux caractéristiques

décrites pour la première phase de croissance (Yamazaki. 1965). Aucune trace de vitellus ne peut

être observée (fig. 19).

Les Poissons qui reçoivent 0,1 pg «le c-GTH g «le poi«ls présentent un ovaire différent :

le diamètre de l'ovocvte est augmenté, il passe de 110 a 239 p. Lin anneau de vitellus est visible

pour «le nombreux ovocytes (fig. 20).

Tableau XIII

Régénération de la vitellogénèse chez le Cyprin hypophysectomisé

traité à l'hormone gonadotrope de la Carpe (BG 2-116 type IV)

Dose c. GTH

[H/l/i'N»)

Quantité d'hormone

reçue (fig)

RGS

Diamètre des

ovocytes (|i )

Vitellogenèse

au début

j 4 ’ 1

> 3, 9

Témoin

(1,9

a la fin

2,3

(O, 5

75 à 140

0.8

3,3

1 anneau de

0,1

1 .

2,7

110 a 230

vitellus

1.8

2,6

2,8

plusieurs anneaux

4,7

100 a 310

de vitellus

3,9

150

2,4

10,9

300 à 690

vitellogenese complété

* Ce Poisson a été sacrifié après 20 jours de traitement alors que les autres ont été sacrifiés entre le 50“ et

le 70“ jour.

Les Poissons qui reçoivent les doses supérieures de 1 et 5 pg g de c-GTH présentent une

vitellogénèse beaucoup plus avancée. Le diamètre des ovocytes passe de 300 à 700 p et des vési¬

cules de vitellus en anneaux concentriques sont observées à la périphérie du cytoplasme (fig. 21).

L'étude histologique de l’ovaire du Poisson dont l’élévation de la valeur du RGS est la

pins importante permet d'apporter certains éléments complémentaires : la stimulation «le la vitello¬

génèse apparaît très élevée et un grand nombre d'oeufs sont proches de la maturité. Cependant, un

graml nombre d'œufs sont beaucoup moins développés, leur diamètre est de 500 p en moyenne.

Source : MNHN, Paris

ÉLISABETH K! I(/'

a-«;éhai«i>

la zona radiata commence à s'épaissir et à être colorée en rouge par l'éosine. Des corps alréliques

sont également observés. Certains «l’entre eux présentent un phénomène curieux, une reprise «le

la vitellogénèse.

line deuxième observation doit être signalée, les ovogonies paraissent être également le

siège d’une stimulation, nous avons pu observer (lig. 22) deux ovogonies en cours de multipli¬

cation comme le témoigne la concentration des chromosomes à la plaipie équatoriale au cours de

la prophase meiotique.

Le troisième point observé sur ces coupes est la stimulation «les cellules folliculaires (fig. 23)

qui entourent l'ovocyte et la zona radiata. Ces cellules sécrètent les stéroïdes sexuels (l.AMBKKT, 1968).

L’effet «le l’extrait brut d'hypophyses «le Carpe a ici également été étudié. L'injection de

l'équivalent «le 5 pg d'hvpophvses «le Carpe induit aussi une forte stimulation de la vitellogénèse.

Le «liamètre des ovocytes est de 300 à 400 p. Plusieurs anneaux de vitellus et des vésicules vitellines

sont présents dans le cytoplasme.

B. — Action de la c-GTH sur divers paramètres biochimiques de l'activité conadiquk

1. — Chez l’Anguille

La fixation du phosphore 32 P sous forme de Na 2 H 32 P() 4 ) par le testicule de l'Anguille mâle

est augmentée sous l'influence «les préparations G 52 et BG 121 (types I et III) : les réponses

observées sont significatives. Par exemple, pour la préparation G 52 (type I). le test d'hétérogénéité

conduit à une probabilité p <0.05 avec F — 4,9, ni = 1. n 2 = 20 (fig. 24 A).

2. — Chez le Cyprin

De même la teneur en eau «lu testicule du Cyprin est augmentée proportionnellement avec

le logarithme de la dose injectée (préparation G 52. type I). La corrélation est significative

(Y = 7,5 X + 73,3. r = 0.97. «11 - 4 p < 0,01 ) (fig. 24 B ).

Nous avons aussi recherché l'action de la c-GTH sur l’ailényl-cvclase de l'ovaire (Y.-A. Fon¬

taine et al. 1970).

Des homogénats d'ovaires entiers de Cyprin sont incubés avec des doses croissantes «le la

préparation gonadotrope et l'activité adényl-cyclasique est déterminée en mesurant le a M P-AMP C

formé à partir du a 32 P-ATP marqué, placé dans le milieu d'incubation (Krishna et al.. 1968).

Les résultats obtenus sont résumés dans la figure 25. L'AMP C formé augmente avec le logarithme

de la ilose d'hormone placée dans le milieu d'incubation. Ces résultats ont été obtenus sur des ovaires

en «lébut de vitellogénèse. Le diamètre moyen des ovocytes est alors de 60 à 20(1 p,. le KGS est

faible (2,5 % en moyenne).

C. — Discussion et résumé

Les différentes préparations purifiées à partir de la poudre acétonique d'hypophyses de

Carpe en suivant l'activité au moyen du test de spermiation «le la Grenouille se révèlent posséder

toutes les caractéristiques définissant une hormone gonadotrope (c-GTH. hormone gonadotrope «le

la Carpe). Elle agit en effet sur la spermatogénèse et sur l'ovogénèse chez le Cyprin hvpophv-

sectomisé. Elle intervient au moment «le la spermiation et vraisemblablement «le l'ovulation. En

effet, Breton et al. (1927) ont montré par «losage immunologique une augmentation (5 à 10 fois)

du taux plasmatique d'une substance immunologiquement similaire à la c-GTH au moment «le

l'ovulation.

Source : MNHN, Paris

HORMONE GONADOTROPE DE I.A CARPE

Anguille

Radioactivité il» testicule P 32 Teneur en eau

(% de la dose injectée ) (%dupoidsdutesticule)

Figure

A- fixation du 32 P par le testicule de l'anguille en fonction ae ia aose d'hormone gonadotrope injectée,

préparation G52 (type I)

préparation BG 121 (type III)

Moyenne Y * erreur type de la moyenne

B- variation de la teneur en eau des testicules du cyprin en fonction de la dose d'hormone reçue,

préparation G52 (type I)

Source : MNHN, Paris

ÉLISABETH BURZAWA-liÉRAHD

Augmentation de la quantité

d'AMPc formée, en p.cent

des témoins

Figure &S~

Stimulation de la formation d'AMP par des homogénats d'ovaires de cyprin (résultats cumulés de quatre

expériences) sous l'influence de'l'hormone gonadotrope de Carpe (BG 2-G8 type IV) chaque point corres¬

pond à un tube d'incubation et les tirets aux moyennes.

Milieu d'incubation Tris HCl 29. 10 _3 M pH 7,4 „

Phosphoénolpyruvate 7,2 10 -J M

Pyruvate kinase 12 unités/ml

ATP- 32 P 1,33. 10 _3 M

Albumine 167ug/ml _

Magnésium (Mg* + ) 4,3. 10 ^

Théophylline 9. 10 -J M

Saccharose 0,1M

Durée d'incubation 15 ran Protéines ovariennes environ 1,07 mg/ml

Température d'incubation 20°C

Source : MNHN, Paris

HORMONE GONADOTROPE DE LA CARPE

III. — ETUDE DU RAPPORT D’ACTIVITE

HYPOPHYSE DE CARPE

UNICITE DE L’HORMONE GONADOTROPE DE LA CARPE

A. — Résultats

L’activité biologique de l’hormone gonadotrope a été déterminée au moyen de différents

e-GTH

tests. Pour chacun d’eux, le rapport --—--:--- a été déterminé. On peut penser que

hypophyse de Carpe

si une autre hormone gonadotrope était présente dans l’extrait hypophysaire brut de la Carpe,

la valeur du rapport serait variable. En effet, chez les Mammifères, où il existe deux hormones

gonadotropes, on observe que les différents tests ne possèdent pas la même sensibilité aux LH

et FSH.

Le tableau XIV résume les résultats obtenus. Lorsque pour chaque préparation nous compa¬

rons le rapport déterminé par la spermiation de la Grenouille avec celui déterminé sur un autre

test, aucune différence significative n’est observée. Seule la détermination par le dosage radio¬

immunologique ne conduit pas au même résultat : la valeur du rapport semble inférieure à

celle déterminée par le test de spermiation de la Grenouille. Cette différence peut être due à

l’existence d’impuretés protéiques fortement antigéniques dans la c-GTH : la présence de faibles

quantités de TSH en particulier ne peut être exclue. La réponse de l’extrait hypophysaire de

Carpe serait alors déterminée par excès.

Tableau XIV

Etude du rapport d’activité -----;-

hypophyse de Carpe

sur différents receveurs Poissons Téléostéens et Amphibiens

REFERENCES

ESPECES

TEST

G-52

BG2-67

BG2-116

Hyp. Carpe

Hyp.Carpe

Burzawa - Gérard

et Y. A. Fontaine(1965)

Y. A. Fontaine et

al. (1970 )

Anguille

Cyprin

fixation de 32 p

par le testicule

adenyl-cyclase

de l'ovaire

11,6

(4,4-30,3)

Burzawa - Gérard

et Y. A. Fontaine ( 1965 )

Hobson et Barr 1966

Rana esculenta

Rana pipiens

Spermitation

6,8

(4,3-10,7)

6,6

(10-22)

12,5

(9,2-16,7)

idem

Xenopus laevis

Spermitation

11,2

Burzawa-Gérard

et Y. A. Fontaine (1965 )

Alytes obstetri-

cans

Gonflement des

testicules

7,4

(0,23-41,7)

Breton et al.

(données inédites)

Radioimmunologie

6,1

Source : MNHN, Paris

Kl .ISABFTH Bl HZ A W A-CKRARD

B. — Discussion

Dès 1965. nous avions éinis l'hypothèse qu'une unique hormone gonadotrope pouvait être

présente dans l’hypophyse de la Carpe (K. Bt hzawa-Gérard et Y.-A. Fontaine. 1965). D'une part,

l'étude biochimique de l'hvpophvse de la Carpe met en évidence la présence d'une seule fraction

c-GTH

gonadotrope (c-GTH) et d'autre part la détermination du rapport il activité-------

hypophyse de Carpe

par divers lests de l'activité gonadotrope des Vertébrés inférieurs montre que celui-ci reste statis-

tiquement constant. La c-GTH manifeste tous les types d'activité exercés par l’extrait hypophysaire

brut.

L'étude de la régénération de la gonade du Poisson hypophvsectomisé que nous avons décrite

précédemment a complété ces résultats et permis de montrer que la même glycoprotéine pouvait

restaurer la spermiation et la spermatogenèse chez le mâle et la vitellogénèse en particulier chez

la femelle.

Cependant, les rendements de la spermatogenèse et de la vitellogénèse ne sont pas aussi

élevés que chez les animaux « sauvages ». L’existence îles phénomènes de picnoses ne peut être

négligée : ils constituent un facteur limitant. L’excès d’hormone au moment des injections peut

être un facteur qui favorise la picnose des cellules, la concentration de l'hormone circulante étant

beaucoup plus faible que celle des solutions hormonales injectées. De plus, ('hypophysectomie

entraîne un manque de toutes les stimulines et une bonne partie du fonctionnement endocrinien

du Poisson se trouve perturbée, en particulier par le défaut des hormones. Cependant, l’injection

d’extrait hypophysaire brut n'est pas non plus totalement satisfaisant mais il est possible «pie les

proportions des diverses hormones dans l'extrait acétonique d'hvpophvses de Carpe ne soient

pas adéquates pour une normalisation totale du fonctionnement de la gonade du Cyprin. Enfin,

les conditions de lumière et de température dans lesquelles les expériences ont été réalisées peuvent

ne pas être optimales pour la maturation sexuelle du Cyprin : nous avons en effet observé que

les Poissons non hypophysectomisés, placés dans ces conditions, ont un RGS plus faible que ceux

gardés dans des conditions naturelles.

Notons enfin qu'une action de la c-GTH sur la sécrétion des stéroïdes sexuels par les

cellules folliculaires est suggérée par le fait que cette hormone stimule la vitellogénèse.

C. — Résumé et conclusion

L'hormone gonadotrope (c-GTH ) de la Carpe possède toutes les activités gonadotropes pré¬

sentes dans l’hvpophyse de la Carpe. File est capable en effet de restaurer, à elle seule, la spermato-

génèse et la vitellogénèse du Poisson hypophvsectomisé. Elle permet la spermiation du mâle et

c-GTH

elle intervient au moment de l'ovulation chez la femelle. De plus, le rapport ----

hypophyse de Carpe

déterminé sur les divers tests de l'activité gonadotrope des Vertébrés inférieurs reste constant. Tous

ces résultats conduisent à penser que la glycoprotéine, stimulant les gonades, que nous avons

purifiée à partir d'hypophyses de Carpe, est la seule hormone gonadotrope présente dans ce

matériel.

IV. — COMPARAISON SUR DIFFERENTS RECEVEURS

DE L’ACTIVITE BIOLOGIQUE I)E L’HORMONE GONADOTROPE DE LA CARPE

AVEC CELLES DES LH ET FSH DE MAMMIFERES

A. — Recherche de l'activité biolocique des hormones gonadotropes de Mammifères

sur les Vertébrés inférieurs

Nous avons recherché l'action de la LH et de la FSH sur les différents tests appliqués

précédemment à 1 étude de l’activité gonadotrope de l'hypophyse de la Carpe.

Source : MNHN, Paris

Volume des cellules des testicules mm 3 /g de poids corpororet

hormone gonadotrope de i.a carpf.

Comparaison de l'action des hormones LH et FSH des Mammifères et de la c-GTH sur la régénération de la gonade

du cyprin hypophysectomisé.

Les valeurs indiquées

dans les testicules :

en abscisse correspondent aux volumes occupés par

espaces intralobulaires (cellules interstielles et

Sertoli Cellules de Sertoli

GA et GB Spermatogonies A et B

Sptide Spermatides

Scyte Spermatocytes I et II

Spz Spermatozoïdes

Picnose Cellules picnotiques dans les lobules

lumière des lobules partie de la lumière des lobule

RGS Rapport gonado-somatique

;s différentes cellules présentes

:onjonctif en dehors des lobules)

non occupée par les spermatozoïdes

H_ témoin non hypophysectomisé

H témoin hypophysectomisé

c-GTH hormone gonadotrope de Carpe (1 ug/g/injection)

LH-Mg hormone luteinisante de Mouton (CNRS) (10 pg/g/injec tion)

FSH-M 2 hormone folliculostimulante de Mouton (CNRS) (10 pg/g/injection)

Source : MNHN, Paris

ÉLISABETH BIIRZA WA-EÉRARR

4MP c formé pendant l'incnbatinn

(picomoies)

4MPc formé pendant

l'incubation (picomoies)

Témoin 0,1 fig ijig lopg

c-GTH

lOfÈ iopg

LH FSH

NIH Bs NI H S 11

o.epM

F Na

Témoin ipg lojig

c-GTH

Addition partnbe d'incubation

1® ,f expérience

FSH HCG

Addition par tube Vincubation

2 eine eipérience

Comparaison de

l'activité de la c-GTH, la o-LH, la o-FSH et la HCG

l'adenyl-cyclase de l'ovaire de Cyprin

Milieu

d'incubation

Tris-HCl 29.10 -3 M pH 7,4

Pyruvate kinase 12 unités/ml

Albumine 167 ug/ml

Théophylline 9.10 -3 M

Protéines ovariennes?lmg/ml

Phosphoénolpyruvate 7,2.10 -3 M

ATP- 32 p 1,33 10" 3 M 30 cpm/p Mole

Magnésium <Mg ++ ) 4,3.10 -3 M

Saccharose 0,1M

Durée d'incubation 15 mn

Température d'incubation 20’C

Source : MNHN, Paris

HOliMONK (.(> YADOTItOI’l'. UK LA CARPE

1. — Anguille

L’influence éventuelle des hormones gonadotrope» des Mammifères a été recherchée sur

la fixation du phosphore fl P par le testicule île l'Anguille.

o) LH (LH-NIH-S 11)

La fixation du phosphore n’est pas augmentée, quelle que soit la dose injectée (10, 100

ou 1.000 pg animal). Le calcul statistique réali»é sur l'ensemble des animaux (témoins et traités)

conclut à l’homogénéité de l'ensemble considéré (F — 1.90. dl| = 3. dh — 18. 0.05 < p <0.2).

b) FSH (FSH-NIH-S 3)

50. 300 ou 2.000 pg de la préparation hormonale ont été injectés aux Anguilles.

L’ensemble des données traitées statistiquement (test d’homogénéité F = 1,10, dl, 3. dL —20,

p < 0,20) nous permet de conclure à l’absence de réaction.

L'hormone gonadotrope de la Carpe, comme nous l'avons vu (cf. fig. 24 A), donne une

réponse statistiquement différente de celle des témoins à partir d'une dose seuil de 2 pg de la

préparation BG 121 (type III).

a) Régénération de la gonade du Cyprin hypophysectomisé

Nous avons recherché l’éventuelle régénération de la gonade mâle île Cyprin hypophysectomisé

sous l’influence des préparations hormonales LH-Mj (C.VR.S.) et FSH-Mi (C.VR.S.) (Billard

et al.. 1970). Ces hormones n'ont aucune action. La spermatogénèse n'est pas restaurée, la

structure du testicule est plus dégradée que sur les animaux hypophysectomisé» : il est impossible

d’individualiser les lobules et d'identifier les cellules de Sertoli. Comme chez le» animaux témoin»

hypophvsectomisés, l'importance du conjonctif extra-lobulaire est responsable de» valeurs relati¬

vement élevées du RGS. Nous avons résumé l'ensemble des résultats sur la figure 26.

b) Mesure de l’activité adényl-cvclasique de l'ovaire en prévitellogénèse

Aucune des hormones gonadotropes hypophysaire» des Mammifères (LH et FSH) n'est capable

de stimuler l'adényl-cyclase à de» concentrations même 100 fois plus élevées que celles utilisées

pour la c-GTH (Fontaine et al.. 1970). L'hormone chorionique humaine HCG-1 l I tube d'incu¬

bation) ne stimule pas non plus l'adényl-cyclase de l'ovaire de Cyprin. L'ensemble des résultats est

résumé dans la figure 27.

3. — Amphibiens

Rappelons que les extraits hypophysaires de Poisson sont capables d'induire la spermiation

de la Grenouille Rana escutenta (Fontaine et Chauvel, 1961). Barr et Hobson (1964) l'observent

également chez Xenopus taevis.

Les hormones gonadotropes LH et FSH ainsi que la HCG induisent également la spermiation

de la Grenouille (tableau XV). La LH a ici été utilisée dans certains cas comme hormone de réfé¬

rence pour exprimer l’activité des différentes préparations de la c-GTH. Cependant, comme nous

l'avons décrit dans « Matériel et Méthodes ». la sensibilité relative de la gonade de la Grenouille à

la LH est variable au cours de l'année.

Le test de gonflement des testicules du Têtard d'Alytes obstetricans (Delsol et Flatin. 1961)

a été également utilisé. Leraï (1963) observe une réponse positive avec un extrait brut d'hypo¬

physes de Carpe. Les hormones LH et FSH de Mammifères comme la c-GTH donnent des réponses

positives (Delsol et al., 1970). L'ensemble des résultats est résumé dans le tableau \\.

Les hormones gonadotropes LH et FSH n'agissent pas sur ces deux receveurs avec la même

efficacité relative. La FSH apparaît plus active chez le Têtard il'A/vtes que chez la Grenouille

Source : MNHN, Paris

ÉLISABETH Hl K/AWA-GÉRARD

(Bhiizawa-Gérard Pt Y.-A. Fontaine. 1965). I.** rapport d’activité —— a été déterminé

LH-INIH

chez d'autres Amphibiens et Reptiles par différents auteurs (cf. Bhrzawa-GÉRARD et Y.-A. Fon¬

taine, 1972) et il varie de façon importante.

Tableau XV

Détermination Je la José moyenne effective sur Jes tests utilisant un Amphibien

comme receveur Jes hormones gonaJotropes (I.H et FSH) Jes Mammifères

et Je l'hormone gonaJotrope Je la Carpe (c-G’l'H)

Test

D SOflig/nintal)

LH NIH -81

FSH NIH SI

c-GTH

Spermiation de la Grenouille

Rana esculenta

2,6

(1,9 -3,5)

31,2

(25,6 -38,0)

8,0

(6,4-9,9)

Gonflement du testicule du

têtard Alytes obstetricans

0,2

(o.i -0,3;

0,5

(0,3 - 0,8)

1,6

(0,9- 2,6)

La gonade des Amphibiens. comme celle des Reptiles, possède donc l'intéressante propriété

d’étre sensible non seulement à leur propre hormone, mais aussi aux hormones gonadotropes des

Mammifères et îles Poissons. L'activité relative de ces différentes hormones n'est généralement pas

la même, selon l'animal choisi, et aussi selon certaines conditions extérieures.

B. — Recherche de l’activité biologique de l'hormone gonadotrope de la Carpe sur le Rat

1. — Déplétion Je V acide ascorbique Je l'ovaire chez la Ratte pseuJogestante

Ce test (Parlow . 1967) a été appliqué dans les conditions décrites par Pelletier (1963) ;

100 et 500 |rg de c-GTH (BG 2-67, type IV) n'ont aucune action tandis qu'une régression signi¬

ficative avec des doses faibles de LH (LH-.MH-B 5) est observée.

Les résultats sont représentés sur la figure 28 (test d’homogénéité F = 4,8, n = 1-9,

0,05 < p < 0,20).

2. — Augmentation Je poiJs Je l’ovaire Je la Ratte prépubère traité par le HCG

Ce test a été appliqué dans les conditions décrites par Steelman et Pohley (1953) et en

présence de 20 UI de HCG.

Différentes préparations de c-GTH ont été utilisées pour ce travail. 200 p.g de G 52 ne

possèdent aucune activité sur ce test (Burzawa-Gérard et Y.-A. Fontaine, 1965). Il en est de

même avec des doses beaucoup plus élevées de préparations plus purifiées. I,es résultats sont résumés

dans la figure 29. l^e traitement statistique des données expérimentales (test d'homogénéité F = 2,6,

•Il — 1-9, p > 0,05) nous permet de conclure à l'homogénéité des lots d'animaux témoins et de

ceux ayant reçu l'hormone gonadotrope de la Carpe.

Source : MNHN, Paris

MORMONE GONADOTROPE DE l J

Acide ascorbique (|ij/îoomg d'ovaire)

Figure&8

Inactivité de la c-GTH sur la concentration de l'acide ascorbique de l'ovaire de Ratte pseudo-gestante

» -* LH-NIH-B5

•-« BG 2-67

T Y + erreur type de la moyenne

Source : MNHN, Paris

ELISABETH BURZAWA-LF.H AHD

Poids des ovaires (mg)

150

100

10 100 1000

dose injectée par animal (|ig)

Figure 3.9

Inactivité de la c-GTH sur le poids de l'ovaire de Ratte prépubère traitée

par la HCG.

■-a FSH-NIH-S11

à. A BG 32 B

•_«BG 19

f Moyenne Y * erreur type de la moyenne

V. — DISCUSSION

A. — Nature hormonale

La méthode préparative que nous avons étudiée au cours du chapitre précédent nous a

permis d'obtenir une glycoprotéine d'un degré «le pureté élevé possédant une action gonadotrope.

Cette action est clairement définie par les expériences de régénération réalisées sur le

Cyprin hvpophysectomisé. Chez le mâle, la spermatogénèse est restaurée jusqu'à émission du

sperme, chez les femelles, la vitellogénèse est reprise et elle se poursuit complètement. De plus,

l'élaboration du vitellus dans les ovocytes, d'une part et d'autre part la stimulation des cellules

folliculaires que nous observons constituent une preuve indirecte de la sécrétion accrue des stéroïdes

sous l'influence de la c-GTH. Par ailleurs. Yamazaki et Donaldson (1969), avec une préparation

gonadotrope provenant d'un autre Poisson Téléostéen (Oncorhynchus tschauytscha) mais possédant

des caractères biochimiques très voisins «le la c-GTH (Donaldson et al.. 1972), observent «jue

l’onc-GTH stimule la 3 (5 hydroxvstéroïdéhydrogénase «lu testicule du Cyprin hvpophysectomisé,

suggérant ainsi qu'une stimulation de la stéroïdogénèse a lieu sous l'influence «le cette hormone.

Source : MNHN, Paris

HORMONE LONADOTROPF. DE LA CARPE

Enfin. la présence de la e-GTH dans l'hypophyse, surtout dans la pars distalis proximale,

a été vérifiée par immunofluorescence (Billaud et al.. 1970). Cette même glycoprotéine, ou du

moins une substance ayant les mêmes propriétés antigèniques, est présente dans le sang du

Cyprin. Les dosages radio-immunologiques du plasma du Cyprin mettent en évidence un rythme

nycthéméral du taux plasmatique et une élévation de ce taux au moment de l'ovulation (Breton

et al.. 1972).

Nos préparations agissent également sur divers paramètres biochimiques de l'activité gona¬

dique <les Poissons Téléostéens.

o) L'activation de l'adényl-cyclase suggère que l'hormone gonadotrope de la Carpe agit

par l'intermédiaire de 1*AMP, pour au moins une partie de ses activités sur la gonade.

b) La fixation du phosphore radio-actif par le testicule de l'Anguille est augmentée sous

l'influence de la c-GTH. I ne réponse similaire est observée avec le testicule du Poussin sous

l'influence des hormones LH et FSH de Mammifères (Brkneman et al., 1962). Cette action reflé¬

terait le taux de renouvellement de certaines phosphoprotéines et est considérée comme un indice

du taux d'activité de l'organe.

c) La c-GTH augmente la teneur en eau du testicule du Cyprin. Clemens et Grant (196-1)

interprètent cette réaction comme représentant la mobilisation de l'eau nécessaire à l'élaboration

du plasma séminal.

L'ensemble de ces données montrent que la glycoprotéine purifiée possède toutes les carac¬

téristiques définissant une hormone. Nous sommes bien en présence d'une hormone gonadotrope

hypophysaire de la Carpe.

B. — Nombre des hormones

Chez les Poissons Téléostéens comme chez les Mammifères, l’hypophyse est la glande qui

sécrète les stimulines indispensables au fonctionnement îles diverses glandes endocrines et de la

gonade en particulier. De même, les Poissons Téléostéens possèdent des formations tissulaires

homologues à celles de la gonade des Mammifères. En conséquence, l'idée que deux hormones

gonadotropes de type LH et de type FSH existeraient chez les Poissons Téléostéens a été souvent

envisagée (Pickford et Atz. 1957 : Dodd. 1960 : Hoar, 1966 : Hyder. 1970).

Diverses données de la littérature semblent en faveur de cette hypothèse :

n) Deux types de cellules en relation avec la fonction gonadotrope ont été décrits dans

l'hypophyse de nombreuses espèces parmi les Vertébrés inférieurs. Ils ont été interprétés

comme sécrétant des hormones de types LH et FSH (Olivereai et HeRLANT, 1960 : Olivereai;.

1954 : Hoar. 1966).

b) L'hypothèse de l'existence des deux hormones gonadotropes chez les Poissons résulte

également des résultats obtenus par l’injection des hormones LH et FSH à des Vertébrés inférieurs.

Le fait, par exemple, que la LH. mais non la FSH. soit quelquefois active chez le Poisson a conduit

de nombreux auteurs à postuler l'existence d'une hormone de type LH chez le Poisson. I ne

deuxième hormone de type FSH devenait nécessaire (Hoar. 1966).

En fait, l'existence chez les Mammifères de deux hormones n'a été définitivement retenue

qu'à partir du moment où les méthodes de préparation ont permis de séparer les deux hormones.

Or. notre travail met en évidence, par l'application des mêmes méthodes biochimiques de frac¬

tionnement, l'existence, chez un Poisson Téléostéen. la Carpe, d'une unique hormone capable

de stimuler toutes les étapes de la gamélogénèse.

D'autres travaux ont étendu cette hypothèse à un salmonidé. Yamazaki et Donaldson (1968)

ont purifié l'hormone gonadotrope tVOncorhvnchus tshauytscha et cette hormone stimule de

nombreuses activités de la gonade des Vertébrés inférieurs (Sindarahaj et al., 1971 ; Liley et

Donaldson. 1970 : Lic.ht et Donaldson, 1970).

Source : MNHN, Paris

ÉLISABETH Bl'HZAWA-LÉRAHD

De plus, des études histologiques récentes mettent en cause chez divers Poissons Téléostéens la

dualité des cellules sécrétrices des hormones gonadotropes. Il semble en particulier que certaines

cellules qui se modifient après gonadectomie ne soient pas gonadotropes mais plutôt productrices

de TSH (Schreibman. 1964 : Van Overbeeke et Mac Bride, 1967 ; Mac Bride et Van Overbeeke,

1967). I.eatherland (1969) et Mattheu (1970) concluent à l'existence dans l’hypophyse d’un seul

type cellulaire en relation avec la stimulation des gonades.

Certaines données de la littérature et en particulier le travail de Hydeh (1970) chez Tilapia

suggèrent l'existence, dans certains cas. d’une stimulation différentielle des tissus gamétogénétique

et stéroïdogène. L’hypothèse d'une seule hormone gonadotrope chez les Poissons Téléostéens

peut-elle être conciliée avec ces faits '!

Rappelons d'abord que la gonade des Poissons Téléostéens possède, comme celle des Mam¬

mifères d’une part un tissu germinatif qui assure la synthèse des gamètes mâles ou femelles et

d’autre part un tissu endocrinien qui sécrète les stéroïdes sexuels. I^e tissu gamétogénétique est

similaire à celui îles Mammifères et a été décrit par de nombreux auteurs, par exemple Yamazaki

(1965) ; Billard (1969) : Lambert (1969). Le tissu stéroïdogène de la gonade du Poisson a été

étudié chez certaines espèces. Lambert et Van Oordt (1965). Bara (1965) ont montré chez la

femelle que les cellules folliculaires sont le siège de la synthèse stéroïdienne. Chez les mâles,

le tissu interstitiel est présent (Marshall et Lofts, 1956 : Delrio et al., 1967). Les cellules de

Sertoli seraient, elles aussi, capables de synthétiser les stéroïdes sexuels (Marshall et Lofts, 1956 ;

Yaron, 1966 ; O’Halloran et Idler, 1970 ; Collenot, 1971).

1. — Si une unique hormone assure effectivement de façon directe la stimulation de toutes

les fonctions de la gonade, c’est donc qu’elle peut se lier avec les récepteurs présents dans les

divers types de tissus gonadiques. Diverses hypothèses peuvent cependant concilier cette idée avec

une stimulation différentielle des divers tissus.

a) Les récepteurs différents peuvent être sensibles â des concentrations d’hormones différentes.

Sundararaj et al. (1972) ont étudié chez le Poisson-chat (lleteropneustes fossilis) l’induction

de la vitellogénèse, le maintien de la vitellogénèse et l’ovulation après injection de la fraction

gonadotrope obtenue après filtration de l’extrait brut d'hypophyses de Carpe sur Sephadex G 100.

Ils observent que de fortes doses sont nécessaires pour induire la vitellogénèse mais que des doses

très faibles sont suffisantes pour la maintenir lorsque les œufs sont proches de la maturité. L’ovu¬

lation se produit après injection d'une forte dose d’hormone. Rappelons à ce propos que Breton

et al. (1972) ont observé dans le plasma du Cyprin une forte décharge d’hormone au moment de

l'ovulation. La concentration est alors 5 â 10 fois plus élevée que chez les témoins.

La concentration de l’hormone peut elle-même varier avec des facteurs extérieurs qui

exercent un rôle particulièrement important chez les Vertébrés inférieurs. Les conditions de tempé¬

rature. de lumière et d’environnement conditionnent pour de nombreuses espèces le moment de

l’ovulation et par suite de la ponte (Yamazaki, 1965 : Ballermann. 1969-1972) ont montré que

l'ensemble température, durée et intensité de l’éclairage agissait très fortement sur la maturation

des gonades et donc sans doute sur la sécrétion de l’hormone gonadotrope elle-même. Les conditions

de température et de lumière peuvent intervenir comme un stimulus extérieur sur le système

nerveux central et provoquer, par stimulation hypothalamique, une décharge de l’hormone

gonadotrope.

b) Les tissus stéroïdogène et gamétogénétique pourraient ne pas être toujours stimulables

par l’hormone simultanément ; l’un des produits résultant de la stimulation du tissu stéroïdogène

pourrait contribuer â la stimulation du tissu gamétogénétique en induisant par exemple la synthèse

de récepteurs dans l'autre tissu. Braun et Hetcher (1970) ont montré que l’ACTH n’était apte à

stimuler l'adényl-cyclase de la cellule adipeuse que dans la mesure où des glucocorticoïdes étaient

présents.

Source : MNHN, Paris

HORMONE GONADOTROPE

CARPE

c) La stimulation d’un des tissus effecteurs de l’hormone pourrait aussi être inhibée. En

effet, certains travaux relatifs à d'autres tissus ont mis en évidence des facteurs capables d’inhiber

l’activation de l’adényl-cyclase par des hormones (Ho et Sutherland, 1971 : Bitensky et al., 1971).

2. — Le rôle d’autres hormones dans la stimulation de certains tissus de la gonade ne peut

enfin être éliminé. L'accroissement au cours de la maturation sexuelle de l'activité de la thyroïde

a été observée par de nombreux auteurs et sur différentes espèces (cf. Barhincton et Matty, 1952 ;

Olivereau, 1954 ; Etienne, 1957). Sundararaj et Goswami (1966-1969) sur Heteropneustes fossilis

hypophvsectomisé induisent l’ovulation aussi bien avec la LH qu'avec les corticostéroïdes. Ils

interprètent l’action de la LH par la stimulation de l’interrénal plutôt que par une action directe

sur la gonade.

Le nombre des hormones gonadotropes chez les Amphibiens et les Reptiles reste encore

indéterminé. Cependant, certaines données de la littérature suggèrent l’existence ici aussi d’une

unique hormone. Van Oordt et de Kort (1969) évoquent la possibilité que les changements

cycliques du testicule au cours de l’année peuvent être expliqués sur la base de l'existence d'une

seule hormone. Des variations saisonnières de la sensibilité de l'épithélium germinal et du tissu

interstitiel à l’hormone gonadotrope permettraient une stimulation successive de ces deux tissus.

Mais aucune conclusion définitive ne peut être apportée avant que des études biochimiques aient

pu être entreprises. Le rôle du système nerveux central par le jeu des peptides hypothalamiques

n’apparaît pas dans ces études.

Chez le Lézard, Licht et Pearson (1969) suggèrent que des changements cycliques du testi¬

cule (Anolis carolinensis) peuvent être expliqués par les variations du taux plasmatique d'une

unique hormone associées à une plus grande sensibilité du tissu gamétogénétique que du tissu

interstitiel. Les hormones LH et FSH chez les Amphibiens ont des effets qualitatifs différents

(Lofts, 1961 ; Eyeson, 1971). Ces résultats pourraient être expliqués par l’existence de récepteurs

hormonaux différents.

Une étude biochimique récente de Papkoff et Licht (1972) apporte des éléments nouveaux

et intéressants. Ces auteurs ont purifié une hormone gonadotrope à partir d'hypophvses de Tortue.

Cette hormone possède certaines caractéristiques biochimiques qui la rapprochent des hormones

gonadotropes LH des Mammifères, cependant elle se révèle inactive sur les Mammifères tandis

qu’elle agit chez le Lézard (Anolis carolinensis) comme le fait la FSH mammalienne.

Chez les Mammifères eux-mêines, l’existence des deux hormones (LH et FSH) semble permettre

d’expliquer facilement la stimulation différentielle des deux tissus gamétogénétique (pour FSH) et

stéroïdogène (pour LH). Cependant, l’idée que la FSH puisse agir exclusivement sur le tissu

gamétogénétique et la LH sur le tissu stéroïdogène n’est plus retenue. Ortavant (1969), par exemple,

signale que la manière dont la gonade répond à l’une ou à l’autre hormone n'est pas constante, elle

est variable selon l’espèce, l’âge et l’origine zoologique de la préparation hormonale. Nous ne

discuterons pas ce problème ici ; citons seulement lieux résultats récents obtenus sur des tissus

isolés. Kuehl et al. (1970) en étudiant la stimulation de l’adényl-cvclase du testicule du Rat (tubule

isolé) ont montré que les deux hormones LH et FSH agissaient sur ce tissu ; ils pensent qu’une

relation quantitative existerait entre les activités des deux hormones à stimuler leurs adénvl-

cyclases réciproques. Kolena et Channinc (1972) ont montré que FSH et LH stimulaient l'adénvl-

cyclase de cellules de la granulosa isolées.

Source : MNHN, Paris

ÉLISABETH Hl K/A VV A-GÉKARD

Ün peut s'interroger sur la signification île l'existence de ces deux hormones et se demander

à quel stade de l’évolution elles sont apparues ? Hartree et Cunningham (1969) ont séparé chez la

Poule deux substances gonadotropes qui. d'après leur action sur le Rat. correspondraient respecti¬

vement à une I.H et une FSH tandis que chez les Reptiles et les Amphihiens l’hypothèse qu'une

seule hormone serait présente, a été émise par LlCHT et al. (1970) et par Van Oordt et de Kort

(1969-1972). Ces résultats suggéreraient que l'apparition de l’homéothermie peut avoir été un

élément en faveur de l'apparition de la seconde hormone (cf. Nicoll dans discussion Burzawa-

Géhakd et Y.-A. Fontaine. 1972). L'acquisition de cette deuxième hormone est devenue alors

nécessaire afin de remplacer la modulation produite par le milieu extérieur et plus particulièrement

par la température.

On peut aussi penser qu'une différenciation croissante des récepteurs gamétogénétique et

stéroïdogène s'est produite afin d'assurer une régulation de plus en plus fine des gonades. Le cas

des Amphihiens et des Reptiles est particulièrement intéressant à considérer de ce point de vue.

En effet, ces animaux sont capables de répondre à la fois à l'hormone gonadotrope du Poisson

et à la LH connue à la FSH. Cependant, la sensibilité de leur gonade à l'une ou à l'autre hormone

est variable selon l’espèce considérée. Ces considérations suggèrent qu'une différenciation des

récepteurs des deux formations tissulaires de la gonade s'est produite. On peut alors émettre l’hypo¬

thèse qu'une seule protéine soit finalement devenue insuffisante à stimuler efficacement les différents

tissus et que la sélection naturelle ait favorisé l’apparition de la seconde hormone gonadotrope

hypophysaire.

C. — Spécificité zoologique

L’existence d'une spécificité zoologique des hormones gonadotropes a été mise en évidence

par de nombreux chercheurs (cf. Pickford et Atz, 1957) et les résultats sont devenus plus nets à

partir du moment où les premiers fractionnements d'hypophyses de Mammifères ont permis de

séparer des fractions possédant soit l’activité folliculostiinulante. soit l’activité lutéinisante.

1. — Entre Poissons Téléostéens

L'ensemble de la bibliographie concernant l'action des extraits hypophysaires de Poissons

sur des receveurs Poissons met généralement en évidence l’efficacité de ces extraits à promouvoir la

maturation des gonades (cf. Pickford et Atz, 1957). Cependant, Clemens et Johnson (1964) ont

observé que l'amplitude de la réponse du testicule du Cyprin (test d’hydratation) varie avec

I espèce du donneur et que cette variation est d'autant plus importante que l’espèce est plus

éloignée du Cyprin receveur. Billard et al. (1972) ne peuvent pas restaurer la spermatogénèse du

Poecilia reticulata hvpophysectomisé avec des extraits hypophysaires de Carpe ; Breton et al.

(1972) observent aussi que la régénération de la spermatogénèse du Cyprin hvpophysectomisé est

d'autant plus satisfaisante que les extraits hypophysaires reçus proviennent d'espèces phylogéné¬

tiquement plus proches du Cyprin. Breton et al. (1972) observe parallèlement l’existence d’une

spécificité immunologique des hormones gonadotropes île différentes espèces de Poissons Téléostéens.

De plus, Y.-A. Fontaine et al. (1972) ont étudié l'activité de l'adényl-cyclase d'ovaire de Cyprin sous

l'influence des hormones gonadotropes de Carpe et d’Oncorhynchus : c-GTH est 36 fois plus active

que onc-GTH. Cette différence n'apparaît pas être due uniquement à des degrés de pureté différents

mais aussi à l'existence d'une spécificité zoologique d’action.

2. - Poissons Téléostéens. Amphibienk et Reptiles

La c-GTH est active sur la gonade des Amphihiens : elle provoque la spermiation de la

Grenouille ( Rana esculenta) et Xenopns laevis (Bahr et Hobson. 1965) et le gonflement du testicule

d Alytes obstetricans. Cette dernière réaction peut être rapprochée de celle décrite par Simon et

Reinboth (1966) qui obtiennent une vésiculisation îles testicules de Xenopus laevis sous l’influence

des hormones gonadotropes LH et FSH comme avec des extraits hypophysaires île Poissons.

Source : MNHN, Paris

HORMONE OONADOTHOI’K DE I.A CARPE

En ce qui concerne les Reptiles. LiCHT et Donaldson (1969) ont montré que la onc-GTH

maintenait les testicules à'Anolis carolinensis hvpophvsectomise dans leur état normal et provoquait

la croissance testiculaire et la spermatogénèse chez îles animaux en repos sexuel, l.a c-GTH est

capable de stimuler l'activité adényl-cvclasique d'un homogénat d'ovaire de Couleuvre ( Coronella

austriara Laurenti) (Burzaw'a-Gérakd et Y. -A. Fontaine, 1972).

3. — Poissons Téléostéens et Mammifères

a) Lorsque l'on considère l'action des hormones gonadotropes des Mammifères sur les

Poissons, l'ensemble des données bibliographiques met en évidence des résultats variables. La FSH

apparaît généralement inactive, la LH, par contre, présente une activité biologique sur certaines

fonctions de la gonade du Poisson.

a) Chez le mâle. — Fontaine (1936) induit la maturation de l’Anguille mâle après

injection de prolans. Ashan (1966) observe sur Couessius plumbeus hvpophysectomisé une action

de I.H identique à celle d'une préparation partiellement purifiée de l'hypophyse de Saumon. De

même, Sundararaj et Nayyar (1967) et Sundararaj et al. (1971) restaurent la spermatogénèse

iVHeteropneustes fossilis hypophyseetomisé après injection de LH, de HCG ou du propionate

de testostérone, mais une préparation gonadotrope de Saumon se révèle 10 fois plus active que

la LH. Chez d'autres espèces, Yamazaki (1965) et Wiebe (1969) obtiennent également des réponses

positives. Hyder et al. (1970) observent une hypertrophie du tissu interstitiel du testicule de Tilapia

sous l’iniluence de HCG. Par contre, l'étude de la régénération de la spermatogénèse montre clai¬

rement l'inefficacité des hormones gonadotropes (LH. FSH. HCG) sur ce receveur. Comme nous

l’avons vu. l'histologie des gonades des animaux traités met en évidence une importante dégra¬

dation de la structure du testicule. .Ni la FSH. ni la LH et le HCG ne sont capables de stimuler

la fixation du phosphore 32 P sur le testicule de l’Anguille. Yamazaki et Donaldson (1968 a)

n'obtiennent pas la spermiation du Cyprin hypophyseetomisé après injection de la LH ou de la

FSH mais ils l'obtiennent avec le HCG.

0) Chez les femelles. — Les hormones mammaliennes se sont généralement révélées inactives

sur la vitellogénèse (cf. Pickford et Atz, 1957) : la LH et la FSH ne stimulent pas l'activité

adénvl-cyclasique de l'ovaire de Cyprin en prévitellogénèse.

Chez Heteropneustes fossilis. la LH est active in vivo sur la maturation et l'ovulation mais

inactive in vitro (Goswami et Sundararaj, 1971). Jalabeht et al. (1972) ont observé sur des

ovocytes de Salmo gairdnerii in vitro l’ineffieacité des hormones o-LH, o-FSH et HCG à provoquer

la maturation et l’ovulation.

L’ensemble de ces données met en évidence la complexité du problème. La spécificité des

récepteurs de la gonade pourrait être plus ou moins stricte selon l'élat physiologique, le sexe et

l’espèce. Les réponses positives sont généralement obtenues chez le mâle et le plus souvent

lorsque le Poisson n’est pas hypophyseetomisé. Lue action indirecte pourrait expliquer certains

résultats positifs. Sundararaj et Goswami (1966) ont montré que, dans le cas iVHeteropneustes

fossilis, la LH stimulait les sécrétions de corticostéroïdes par l'interrénal : ceux-ci ensuite agissaient

sur la gonade en provoquant l’ovulation ou la spermiation. Mais ces corticostéroïdes ne peuvent

à eux seuls rendre compte des résultats positifs obtenus sur la spermatogénèse de certains Poissons.

Une action directe de la LH ne peut être exclue.

b) L’action des extraits hypophysaires de Poisson sur les Mammifères conduit généralement à

des actions faibles ou n'augmentant pas avec la dose (Burzawa-Gérahd et Y.-A. Fontaine. 1965).

La présence dans les extraits hypophysaires de certaines substances agissant sur la propre sécrétion

d’hormones gonadotropes de l'animal expérimental pourrait expliquer les réponses observées.

L’utilisation de l'hormone de Poisson purifiée permet de supprimer d'éventuelles actions hétéro-

Source : MNHN, Paris

FI.ISABF.TH BIRZAWA-OF.KARD

tropes ou pharmacodynamiques. Nous n'avons pas observé d'action de la c-GTH sur les Mammi¬

fères : .cette hormone se révèle aussi incapable de stimuler l’activité adényl-cyclasique d’un

homogénat d'ovaire de Rattes prépubères (Y.-A. Fontaine et al.. 1971).

I,'action d'une part, des hormones gonadotropes de Poisson sur les Mammifères, d’autre

part, des hormones gonadotropes de Mammifères sur les Poissons est limitée ou nulle. Les gonades

îles Amphibiens comme celles îles Reptiles sont au contraire nettement stimulables par ces diverses

hormones. Ce fait, ainsi que les similitudes biochimiques existant entre l’hormone gonadotrope

de la Carpe et celle des Mammifères (même nature glycoprotéique, même poids moléculaire et

structure quaternaire similaire), suggèrent que toutes ces hormones, malgré les différences qui

existent entre elles, sont homologues. Nos résultats et ceux acquis précédemment (Y.-A. Fontaine,

1969) conduisent donc à l'idée que toutes les hormones glycoprotéiques hypophysaires des différents

Vertébrés, qu'elles soient gonadotropes ou thyréotropes, constituent une même famille de protéines

homologues.

Source : MNHN, Paris

HORMONE GONADOTROPE DE I.A CARPE

CONCLUSIONS GENERALES

L’hypophyse des Poissons Téléostéens exerce une actiôn décisive dans la stimulation des

gonades. Quand nous avons commencé nos recherches, on ne savait rien sur la nature chimique

des hormones responsables. De plus, l'utilisation d'extraits bruts d’hvpophvses interdisait toute

conclusion quant au nombre des hormones gonadotropes présentes chez les Téléostéens et quant au

degré de similitude entre ces deux hormones et les gonadotropines des Mammifères FSH et LH qui

avaient été seules purifiées jusque-là.

Nous avons abordé l’étude de ce problème par une analyse biochimique et biologique de

l’activité gonadotrope présente dans l’hypophyse d'un Poisson Téléostéen, la Carpe (Cyprinus

carpio).

1° L’utilisation de diverses techniques de fractionnement (percolation alcoolique, filtration

sur gel, chromatographie sur échangeurs d'ions, électrophorèse préparative sur gel acrylamide) a

permis la purification d’une glycoprotéine (c-GTH). Au cours de ces manipulations, l'activité gona¬

dotrope est recherchée par le test «le spermiation de la Grenouille. L'utilisation d'un re«^eveur

choisi parmi les Antphibiens est intéressante car ces animaux répondent aux hormones gonado¬

tropes des différents Vertébrés. L’activité gonadotrope de la glycoprotéine (c-GTH) est exprimée

en terme de LH-NIH-S 1 ; son activité spécifique est de 1,5 U. Certaines de ses constantes

physico-chimiques ont été déterminées : la composition globale en acides aminés, en sucres et

en sucres aminés, le poids moléculaire (26.000 - 28.000) et le point isoélectrique (5,1).

L’étude de l’homogénéité des préparations obtenues met en évidence la présence dans celles-ci

d’une protéine inactive d’encombrement stérique moins élevé que le facteur biologiquement

actif. Cette protéine inactive, qui est retrouvée même dans les préparations les plus hautement

purifiées, provient en fait d'une dissociation de la molécule active. La structure quaternaire de

celle-ci a été étudiée en suivant les variations de l'encombrement moléculaire de la glycoprotéine

sous l’action de divers agents dissociants. Des résultats semblables à ceux décrits pour les hormones

glycoprotéitjues des Mammifères ont été observés. Ia* caractère instable de la glycoprotéine pourrait

résulter de cette structure.

2° Nous avons étudié l’activité gonadotrope de la c-GTH chez les Poissons Téléostéens. La

c-GTH est capable, chez le Cyprin mâle hvpophysectomisé. de restaurer complètement la spermato-

génèse et d’induire la spermiation : chez la femelle hypophvsectomisée. elle semble aussi capable

de stimuler tous les aspects de la fonction ovarienne et en particulier de restaurer la vitello-

génèse. La c-GTH stimule également divers paramètres biochimiques de l'activité gonailique

(fixation du phosphore 32 P par le testicule de l’Anguille, hydratation du testicule de Cyprin, activité

adényl-cvclasique de l’ovaire de Cvprin). Le rapport d’activité --- - ——-n'est pas

hypophyse de Carpe

statistiquement différent, qu'il soit déterminé par un de ces tests ou par l’étude «le la spermiation

chez la Grenouille.

La c-GTH est donc capable «le reproduire à elle seule les effets gonadotropes de l'hypo¬

physe sur la gonade de Poissons Téléostéens. File apparaît comme l'unique hormone gonadotrope

présente dans l’hypophyse de la Carpe. Ce résultat conduit à l'hvpothèse selon laquelle chez les

Source : MNHN, Paris

ÉLISABETH Bl'H/AWA-I.ÉKAKD

Poissons Téléostéens il existerait une seule hormone gonadotrope. Cette hypothèse a été renforcée

par les données similaires obtenues chez Oncorhxnchus tshawytscha par d'autres auteurs (Yamazaki

et Donalosoiv, 1968).

3" I,'hormone gonadotrope de la Carpe a été comparée aux hormones gonadotropes hypo¬

physaires îles Mammifères. Ce sont toutes des glycoprotéines et elles ont un poids moléculaire

semblable : la composition chimique (amino-acides, sucres, sucres aminés) est différente. L'hormone

gonadotrope de la Carpe serait composée de deux sous-unités mais les caractéristiques d'association

et de dissociation de celles-ci ne sont pas identiques à celles décrites pour les préparations des

LH et FSH ovine et bovine. Des différences plus nettes sont observées sur le plan biologique.

L'hormone gonadotrope de la Carpe apparaît incapable de produire aucune stimulation sur la gonade

d'un Mammifère in vivo et in vitro. Réciproquement, les hormones gonadotropes des Mammifères

sont incapables, dans les conditions de nos expériences, de stimuler la gonade des Poissons.

L’hormone gonadotrope de la Carpe est à la fois différente de la LH et de la FSH. Cependant,

toutes ces hormones sont capables de produire une action gonadotrope sur les Amphibiens et les

Reptiles.

Cette propriété commune associée à une même nature glycoprotéique suggère qu’en dépit de

certaines différences, toutes ces hormones sont des protéines homologues.

Le résultat de cette étude pose deux questions importantes :

A. — Comment la gonade des Poissons peut-elle être régulée par une seule hormone gona¬

dotrope alors qu'elle est constituée de deux types principaux de tissus qui semblent pouvoir, dans

certains cas, être stimulés de façon simultanée ? .Nous supposons que les récepteurs de l’hormone

gonadotrope présents dans ces deux tissus ont des propriétés et en particulier une sensibilité

différentes. Selon la concentration de l'hormone dans le plasma, un seul ou plusieurs types

de récepteurs pourraient être mis en jeu. Par ailleurs, d'autres hormones pourraient intervenir,

par exemple en modiiiant différemment les propriétés de ces récepteurs.

B. — Quand et pourquoi dans l’évolution des Vertébrés deux hormones gonadotropes

sont-elles apparues '!

lin certain nombre de données indirectes suggérant qu'une seule hormone gonadotrope

existerait chez les Amphibiens et les Reptiles, et. s'il se vérifiait que deux hormones sont au

contraire présentes chez les Oiseaux, on serait tenté de relier ce fait à l'apparition de l’homéothermie.

[ ne diminution de l'inlluence modératrice sur la gonade du milieu extérieur pourrait avoir rendu

nécessaire une régulation interne plus line de l'activité sexuelle.

On peut aussi émettre l'hypothèse que le facteur principal dans l'apparition des deux

hormones gonadotropes est la différenciation croissante des deux types de récepteurs présents

respectivement dans les tissus gamétogénétique et stéroïdogène : une seule hormone ne pouvant

plus être reconnue de façon satisfaisante par tous les récepteurs, la sélection naturelle aurait

favorisé l'apparition de la seconde hormone.

Source : MNHN, Paris

HORMONE GONADOTROPE l)K I.A CARPE

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Source : MNHN, Paris

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12 JUIN 1974 .

ÉDITIONS DU MUSÉUM NATIONAL D’HISTOIRE NATURELLE

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38, rue Geoffroy-Saint-Hilaire, Paris (5 e )

C.C.P. : Paris 9062-62

Annuaire du Muséum national cCHistoire naturelle (paraît depuis 1939).

Archives du Muséum national d’Histoire naturelle (depuis 1802. In-4°, sans périodicité).

Bulletin du Muséum national d’Histoire naturelle (depuis 1895 ; 6 numéros par an).

Grands naturalistes français (depuis 1952. Sans périodicité).

Mémoires du Muséum national d'Histoire naturelle (depuis 1936. Depuis 1950, nouvelle série en 3

(puis 4) parties : A. Zoologie ; B. Botanique ; C. Sciences de la terre ; D. Sciences physico-chi¬

miques. Sans périodicité).

Notes et Mémoires sur le Moyen-Orient (depuis 1933. In-4°, sans périodicité).

Publications du Muséum national d'Histoire naturelle (depuis 1933. Sans périodicité).

PUBLICATIONS DES LABORATOIRES DU MUSÉUM

En vente à l’adresse de chaque laboratoire

Bulletin du Laboratoire maritime de Dinard (Ille-et-Vilaine). Depuis 1928.

Objets et Mondes. La revue du Musée de l’Homme. Directeur : M. J. Millot, Palais de Chaillot, Paris (16 e ) ;

depuis 1961 ; trimestriel.

Mammalia. Morphologie, Biologie, Systématique des Mammifères. Directeur : M. J. Dorst, Labora¬

toire de Zoologie des Mammifères, 55, rue Buffon, Paris (5 e ) ; depuis 1936 ; trimestriel.

Index Seminum Horti parisiensis. Service des Cultures, 61, rue Buffon, Paris (5 e ) ; depuis 1882 ;

échange.

Journal d’Agriculture tropicale et de Botanique appliquée, suite de Revue internationale de Botanique

appliquée et d’Agriculture coloniale, depuis 1954. Laboratoire d’ethnobotanique, 57, rue Cuvier,

Paris (5 e ).

Adansonia (suite aux Notulae Systematicae ). Directeur : M. A. Aubréville, Laboratoire de Phanéro-

gamie, 16, rue Buffon, Paris (5 e ) ; sans périodicité.

Revue Algologique. Directeur : M. R. Lami, Laboratoire de Cryptogamie, 12, rue Buffon, Paris (5 e ) ;

depuis 1924.

Revue Bryologique et Lichénologique. Directeur : M me V. Allorge, Laboratoire de Cryptogamie ; depuis

1874.

Revue de Mycologie. Directeur : M. Roger Heim, Laboratoire de Cryptogamie ; depuis 1928.

Cahiers de La Maboké. Directeur : M. Roger Heim, Laboratoire de Cryptogamie, 12, rue Buffon,

Paris (5 e ) ; depuis 1963.

Pollen et Spores. Directeur : M me Van Campo, Laboratoire de Palynologie, 61, rue Buffon, Paris (5 e ) ;

depuis 1959 ; semestriel.

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