MÉMOIRES DU MUSÉUM NATIONAL D’HISTOIRE NATURELLE

Série A. Zoologie. — Tome V, fascicule 2. — Pages 41 à 132.

SUR

PIGMENTS

TÉTRAPYRROLIQUES

PROVENANT D’ANIMAUX MARINS

par René TIXIER

Docteur en Pharmacie

Le présent travail a été effectué tant au Laboratoire de Chimie Orga-

ni que du Muséum National d’Histoire naturelle de Paris qu’à l’Institut

de Biologie physico-chimique (service de Biochimie) de Paris.

Avant d'aborder notre exposé, nous voulons remercier tout particulière¬

ment M. E. Aubel, Professeur de Chimie biologique de la Faculté des Sciences

de Paris, pour le bienveillant intérêt qu’il nous a témoigné et pour les encou¬

ragements qu’il nous a prodigués.

Nous adressons nos respectueux remerciements à M. C. Sannié, Profes-

8eur du Laboratoire de Chimie organique du Muséum, pour l’aide favorable

Ru’il nous a accordée au cours de la réalisation de ce travail.

A M. E. Lederer, Maître de Recherches au C.N.R.S., nous exprimons

notre très vive gratitude pour la constante sollicitude avec laquelle il a

s uivi et orienté nos recherches.

Nous remercions également M. M. Frèrejacque, sous-Directeur, pour

Son aimable accueil au Muséum.

A Mme Y. Khouvine, Maître de Recherches au C.N.R.S., nous sommes

heureux d'adresser nos remerciements pour l'amabilité avec laquelle elle

a mis à notre disposition le spectrophotomètre de Beckman de son service.

Nous désirons remercier M. P. Girard, Directeur de l’Institut de Biologie

Physico-chimique, d’avoir bien voulu nous accepter dans ses Laboratoires.

Nous voulons témoigner notre reconnaissance à tous les chercheurs du

Service de biochimie pour le cordial accueil qu’ils nous ont réservé.

A MM. M. Prenant, E. Aubel et R. Wurmser, Professeurs de la Faculté

des Sciences, nous exprimons notre respectueuse gratitude pour avoir accepté

de faire partie de notre jury de Thèse.

Mixoïau DD M uiéuh, Zoologie, t. V. 4

Source : MNHN, Paris

K. TXXlElt

INTRODUCTION

Le nombre imposant de travaux publiés chaque année sur les chromo-

protéides porphyriniques (hémoglobines, cytochromes, peroxydases, cata-

lascs, ctuorines) témoigne de l’importance accordée par les biologistes et

les chimistes au rôle essentiel joué par ces pigments dans les phénomènes

vitaux. Les propriétés biologiques des chromoprotéides respiratoires sont

dues à leurs groupements prosthétiques, constitués par une porphyrine

liée à un atome de fer bivalent, tandis que leur spécificité est assurée par

le substrat protéique. Le catabolisme de l’hémoglobine, en particulier le

mécanisme biochimique de l'ouverture du cycle porphyrinique avec forma¬

tion de pigments biliaires, fait l'objet de nombreuses recherches, résumées

dans l’exposé de CI. Liebecq (1). En 1945, l’emploi d’éléments marqués

permet à K. Bloch, D. Shemin et D. Rittenberc (2, 3, 4) d’aborder avec

succès l’étude de la formation in vivo de l’hémoglobine, et de montrer que

la synthèse du noyau porphyrinique s’effectue fi partir de substances très

simples telles que le glycocolle et l'acide acétique. Pendant longtemps on

a pensé que les pigments biliaires provenaient à peu près exclusivement

de la dégradation de l'hémoglobine des érythrocytes mûrs. Or les recherches

de J. M. London, R. West, D. Shemin et O. Rittknberg (5, 6, 7) indiquent

que chez l'homme normal au moins 11 pour 100 de la stercobiline, et dans

les cas de porphyrie congénital.; au moins 31 pour 100, proviennent d’une

source autre que celle de l’hémoglobine des érythrocytes. M. Grinstein

et scs collaborateurs ( 8 ) pensent que la coproporphyrine I, l’uroporphyrine I,

la protoporphyrine IX de l’hémine et la stercobiline ont un précurseur

pyrrolique commun ; en outre ils suggèrent (9) que la coproporphyrine III

pourrait être directement synthétisée par l’organisme et se trouver à l'ori¬

gine de la protoporphyrine IX.

Cependant, malgré les apports nouveaux, le mécanisme de la biosynthèse

du noyau pyrrolique, du cycle prophyrinique et des divers types de porphy-

rines n’est pas encore élucidé ; il fait l’objet d’un grand nombre de théories

qui se trouvent exposées dans l’étude critique de P. Maitland (10). La

présence dans les urines de malades, atteints de porphyrie aiguë, d’un dipyr-

rylméthanc (porphobilinogène), pouvant, en milieu chlorhydrique, donner

naissance à un pigment biliaire tétrapyrrolique (porphobiline) et à une

porphyrine (uroporphyrine III) (11), pourrait également servir à élucider

le mécanisme de l’accouplement des noyaux pyrroliques. Les recherches

PIGMENTS TÉTRAPYRROUQU ES

sur la biosynthèse de la prodigiosine (12) et sur les pigments pyrroliques des

Légumineuses (13) sont également d'un grand intérêt.

Bien que la majorité des publications concerne l’Homme et les Vertébrés

supérieurs, nous pensons que des recherches effectuées sur les Invertébrés

pourraient conduire à une connaissance plus approfondie de la biochimie

des pigments pyrroliques et apporter des éléments nouveaux sur leur cata¬

bolisme ou leur biosynthèse. Alors que les chromoprotéides respiratoires

(chlorocruorines, érythrocruorincs, hémoglobines) des Invertébrés sont le

sujet de travaux précis, l’étude des porphyrines et surtout celle des pigments

biliaires sont, dans la plupart des cas, très rudimentaires : il suffit,

par exemple, qu’un pigment vert donne la réaction de Gmelin pour qu’il

soit assimilé à la biliverdine. Nous avons eu l’occasion d’observer le pigment

du Corail bleu (Heliopora cærulea ) ît de constater que ce biochrome, dont

les propriétés étaient identiques à celles de la biliverdine, en était cependant

différent dans son comportement chroinatographique sur alumine (14, 15).

Le même, ainsi que nous l’exposerons ultérieurement, le pigment bleu des

c oquilles de Turbo, bien qu’appartenant à la classe des verdines, possède

une constitution chimique distincte de celle de la biliverdine et de la copro-

glaucobiline. Les pigments des coquilles d 'Haliolis constituent également

une nouvelle classe de bilirubinoïdes à propriétés particulières.

L’origine des pigments tétrapyrroliques des Invertébrés, dont le sang

renferme de l’hémocyanine (chromoprotéide cuivrique non porphyrinique),

est toujours une énigme. Ch. Dhéhé et C. Baumeler (16, 17) pensent que

le pigment rouge d’Haliolis rufescens provient soit de la chlorophylle alimen¬

taire, soit du cytochrome (ou de tout auLre corps à noyau porphyrinique).

Ln aperçu sur la présence de composés ferroporphyriniques et de déshy-

drogénase succinique, chez les animaux marins à sang hémocyanique, est

donné par E. G. Ball et B. Meyehhof (18). Nous nous demandons si l’ori¬

gine des pigments des coquilles de Mollusques ne devrait pas être recherchée

dans des phénomènes de biosynthèse soit totale, soit partielle à partir d’élé¬

ments pyrroliques simples, provenant de la dégradation des phycochromo-

protéides absorbés par ces Invertébrés. Peut-être sommes-nous en présence

des vestiges d’un système de biosynthèse actuellement rudimentaire et sans

utilité pour l’anima).

PIGMENTS PYRROLIQUES DES INVERTÉBRÉS

Les données sur la répartition, la constitution chimique et le rôle biologique

des pigments pyrroliques d’invertébrés sont, non seulement fragmentaires,

mais souvent anciennes et imprécises. L’étude des chromoprotéides respi-

r atoires des Invertébrés sortant du cadre du présent travail, nous renverrons

a l’ouvrage de R. Lemberg et J. W. Legge (19) qui résume l’ensemble de

n os connaissances sur les pigments pyrroliques. Signalons également les

Source : MNHN, Paris

H. TIXIEU

exposés généraux de E. Lederer (20) sur les pigments d’invertébrés et

de D. Fox (21) sur ceux des Coelentérés.

La présence de pigments pyrroliques chez les Coelentérés est d'abord

signalée par H. N. Moseley (1877), puis par C. A. Mac Munn (1885). Ce

dernier pense que le pigment (polyérylhrine), trouvé par H. N. Moseley (22)

chez de nombreux Madrépores, chez diverses espèces d'Actinies et chez les

Méduses Cassiopeia et Hhizosloma, correspond à une hématoporphyrine.

11 montre également l’existence de porphyrines chez les Coraux Flabellum

variabilis et Fungia symmelrica (23) et d’une biliverdine, localisée sous

l’ectoderme et à la base du pied, chez Actinia eipiina et Tealia felina (24).

Le pigment rouge ou violet de l’Anémone de mer Calliadis eftwla ( = Sagar-

lia parasitica), étudié par C. A. Mac Munn, puis par M. Abeloos et G.

Teissier (26), est obtenu à l’état cristallisé (calliactine) par E. Lederer,

G. Teissier et G. Huttrer (26). Sa formule élémentaire C 21 H ï0 O 6 N 4 et

diverses propriétés font penser à un pigment pyrrolique. Il semble que le

pigment rouge de Ceriantlius membranaceus, étudié par C. Fr. Kruken-

berg (27), soit voisin de la calliactine, malgré les différences spectroscopiques

(C. A. Mac Munn). Le pigment du squelette calcaire d'Iieliopora cærulea

Pall. (Corail bleu) est un bilirubinofde, dont les propriétés physico-chimiques

sont entièrement comparables à celles de la biliverdine (R. Tixier) (28).

Ce pigment, que nous dénommons hélioporobiline, se distingue cependant

de la biliverdine par son comportement chromatographique.

Aucun aperçu nouveau sur les pigments pyrroliques des Echinodermes

ne précise le travail de C. A. Mac Munn sur les porphyrines des Étoiles de

mer brunes.

Avant d’aborder l’étude des pigments pyrroliques des Vers, rappelons

que les chlorocruorines ont un groupement prosthétique, la spirographis-

hémine, qui renferme une porphyrine particulière, isolée par M. Fox (29),

puis analysée (30) et synthétisée (31) par H. Fischer et scs collaborateurs.

La constitution chimique de la spirographis-porphyrine ne diffère de celle

de la protoporphyrine que par l'existence d’un groupement aldéhydique

h la place d'un radical vinylique. Signalons également le travail histochi-

mique de Cl. Bloch-Raphael (32) sur la localisation, la formation et la

destruction de l'hémoglobine chez les Annélides polychètes.

Les diverses recherches, effectuées sur la porphyrine d'Eisenia fælida

par W. Hausmann (33) et H. Fischer (34), ne sont pas arrivées à une conclu¬

sion définitive. Par contre, la présence d'une protoporphyrine est mise en

évidence dans les téguments de Lumbricus lerreslris (36) et des cyslicerques

de Tænia solium (36). C. Spiess (37) signale l’existence de pigments biliaires

chez Hirudo medicinalis et G. Georuhiu (38) chez Proloclepsis lesselala.

La ponlobdelline, pigment tégumentaire bleu-verdâtre d’une Hirudinée

Ponlobdella, présente, d’après M. Abeloos (39), les caractères d’une bili-

verdinc.

A côté de ces divers produits du catabolisme de l’hémoglobine existent ,

PIGMENTS TfiTEAPYRROLIQUES

chez les Vers, d’autres pigments pyrroliques d’origine chlorophyllienne.

Une vue d’ensemble sur ces pigments accompagne l’exposé de Ch. Dhéré

et M. Fontaine (40) sur les propriétés chimiques et spectroscopiques de la

bonellinc, pigment vert foncé de la femelle du Géphyrien Bonellia lundis.

Obtenue à l’état pur par E. Lkderer (41), la bonellinc répond à la formule

élémentaire C 31 H S6 0 4 N 4 ; bien que ses spectres soient analogues à ceux

d’une mésopyrrochlorine, elle se différencie de cette porphyrine par la pré¬

sence de deux oxygènes supplémentaires dans sa molécule. De même la

chétoptérinc, pigment vert foncé de l’épithélium intestinal du Chétoptère

(Annélide polychète tubicole) étudié par M. Romieu (42, 43), est un produit

de dégradation des chlorophylles, probablement une phéophorbide. Le

pigment vert du tégument de Phyllodoce viridis, dénommé phyllodocine

Par G. A. Mac. Munn (44), se comporte comme un indicateur de pH (25) ;

celui d 'Eulalia viridis, que G. A. Mac Munn croit identique à la phyllo¬

docine, en est, selon E. Lederer (20), distinct. Enfin, la Lhalassémine,

pigment vert pomme de Thalassema lankesleri, diffère de la bonellinc par

scs propriétés spectroscopiques (45).

Ghez les Crustacés la présence d'une biliverdine est signalée par II. C. Brad-

Ley (46) dans la glande digestive de l’Écrevisse américaine ( Cambarus)

et par E. Lederer (20) dans les racines du parasite Pellogasler paguri.

Ghez les Insectes. H. Fischer et H. Fink (47) trouvent de la protopor-

phyrine et de la coproporphyrine dans les excréments de chenilles de mites.

Les pigments biliaires, décelés chez les Lépidoptères et les Orthoptères,

sont à l’état de chromoprotéides. G’est ainsi que G. von Linden (48) signale

dans les ailes de Vancsses un chromoprotéidc rouge, dont le groupement

prosthétique donne la réaction de Gmelin, tandis que H. Wieland et A.

Lvrtier (49) isolent des ailes de plusieurs espèces de Papillons (Pleris bras-

sira», p. rapœ, P. napi, Goneplerix rhamni, Calopsilia rurinea et C. salira)

un chromoprotéidc bleu, soluble dans l’eau ; ce dernier donne par hydrolyse

ac *de un pigment biliaire : la ptérobiline, dont la formule élémentaire s’ac¬

corde avec celles d’une biliverdine ou d’une glaucobilinc : il s’agit peut-être

d’une biliverdine y. H. Junge (50) étudie les chromoprotéides (insecto-

v erdines) de l’épiderme de diverses espèces d’Orthoptères et des chenilles

de Sphinx liguslri, ainsi que celui de l’hémolymphe de Dixippus morosus.

La couleur verte est due à la présence de deux chromoprotéides, dont les

groupements prosthétiques sont jaunes (caroténoïdcs) et bleu (glaucobiline) ;

cette glaucobiline est différente à la fois de la glaucobiline IX«, de la bili-

v crdinc IXa et de la ptérobiline. Des chromoprotéides rouge et bleu, res¬

semblant. aux phycochromoproléides, sont trouvés par S. Okay dans le

tégument vert de Manlis (51). Ghez les Goléoptères, A. Porta (52) signale

l’excrétion d’un pigment voisin de l’urobiline par les Coccinelles. Chez les

Uiptèrcs, A. Comas (53) mentionne la présence de biliverdine dans les larves

de Chironomus et chez les Hémiptères hématophages, en particulier chez

Phodnius, V. B. Wiggi.esworth (54) étudie la transformation de l’hémo-

Source : MNHN, Paris

?.. TI X IEB

globine ingérée, dont une partie se trouve excrétée à l’état de biliverdine

et d’urobiline.

L'étude des porphyrines et des pigments biliaires des coquilles de Mollus¬

ques faisant l’objet du présent travail, nous pensons préférable d’en donner

ultérieurement un historique détaillé et de ne citer pour l'instant que les

recherches effectuées sur les pigments pyrroliquea dos Limaces et des Aplysjes,

Ch. Dhéré et G. Baumeler (55) confirment la présence d’une porphyrjne

dans le derme à’Arion empiricorum , Alors que L. Don (56) considère le

pigment tégumentairc d’Arion ru/its comme un carbonate d'urobiline,

Ch. Dhéré et G. Baumeler (57, 58) le comparent à la bilirubine et le nom¬

ment ru fine. Le pigment violet pourpre des sécrétions d'Aplysies et limaces

de mer (Aplysia punclala, A. depiluns, A. limacina) fait l’objet de nombreuses

recherches exposées dans les travaux de M. Fontaine et A, Raffy (59)

et de E. Lederer (60). Ge dernier décèle la présence de deux chromopro-

téides pouvant être séparés, soit par relargage, soit par chromatographie

sur alumine. Les groupements prosthétiques de ces chromoproléides sont

facilement dissociés du support protéique soit par l’alcool butylique, soit

par acidification et séparés par chromatographie sur carbonate de calcium.

E. Lederer conserve le nom d'aplysiovioline au pigment violet et nomme

aplysiorhodine Je pigment rouge. Ces deux pigments ont des propriétés

voisines de celles de la mésobilivioline, de la pseudomésobilivioline et de

la mésobilirhodine. Dans un travail préliminaire avec E. Lederer nous

avons chromatographié sur alumine les esters méthyliques des pigments

d'Aplysies et séparé trois bilirubinoïdes : un violet (aplysiovioline), un rouge

(aplysiorhodine) et un brun analogue à une urobiline.

Le seul travail concernant les Tuniciers est celui de D. A. Webb (61)

sur les Ascidies, dont le « vanadium chromogène » est peut-être apparenté

aux pigments biliaires.

D’après cet exposé il apparaît que si la plupart des porphyrines des Inver¬

tébrés sont, semble-t-il, identiques aux porphyrines des Vertébrés, il n'en

est pas de même pour les pigments biliaires, dont l’étude est quelque peu

approfondie : par exemple, la ptérobiline, l'hélioporobiline, la glaucobiline

des ehromoprotéides d’Orthoptères, les bilirubinoïdes de Mollusques...

Nous sommes persuadés qu'une connaissance approfondie des pigments

pyrroliques des Invertébrés doit apporter de nombreuses surprises sur la

constitution chimique de ces biochromes et montrer l'existence d'isomères

nouveaux. L’emploi d’éléments marqués pourrait dans bien des cas permettre

de déterminer l’origine, jusqu’ici obscure, de ces pigments. Malheureusement

l’étude de ces derniers est presque toujours ingrate et décevante ; il est, en

effet, difficile de trouver le matériel désiré en quantité suffisante ; la teneur

en pigments est souvent très faible et leur purification rendue difficile par

leur instabilité,

Source : MNHN, Paris

PIGMENTS TÉTBAPYUROLIQUES

•i7

TECHNIQUES ÇHROMATOGRAPHIQUES

Depuis quelques années, les anciennes lochnjques de séparation des pig¬

ments pyrroliques, longues et imparfaites, font place à l’analyse chromato-

graphique, dont l’emploi non seulement rend plus aisé l'isolement et la

purification de ces biochromes, mais également apporte une plus grande

précision dans leur étude. L’emploi de l’analyse rhromatographjque permet

en eflet de séparer des pigmenta isomères, d'isoler de nouveaux biochromes,

d'élucider le mécanisme de réactions extrêmement complexes, comme par

exemple celle de Gmelin pour les pigments biliaires.

Dans le domaine des porphyrines, les techniques d’adsorption sont uti¬

lisées soit pour concentrer ces pigments et en effectuer une purification

grossière, soit pour séparer leurs esters méthyliqucs et les obtenir è l’état

Pur. En 1936, J. Waldenstrôm (62) propose une technique de chromato¬

graphie sur alumine d’urines porphyriniques, afin d’en étudier l’uroporphy-

nne et les pigments rouges pathologiques. La même année, IL J. Hoffmann

(63), purifiant par adsorption sur talc l'ester méthyliquc d’une uropor-

Phyrine do point de fusion 286°, en isole une uroporphyrine I (PF. 302°)

*d une uroporphyrine III (PF. 261°), identique à celle de J. Waldenstrôm

(64, 65). H, Fischer et H. J. Hofmann (66) expliquent ainsi les points de

fusion anormaux des diverses uroporphyrinos naturelles par la présence

simultanée des isomères I et III. Ces auteurs identifient également par cotte

méthode (a conehoporphyrine avec l’uroporphyrine I.

C. Watson et sos collaborateurs mettent au point l’analyse chromato-

graphique des esters méthyliques de la protoporphyrine (67, 68, 69), des

c 0proporphyrines (70) et des uroporphyrines (71, 72) en employant comme

udsorbant soit le carbonate do calcium, soit l’alumine. Ces auteurs pensent

fiue l’uroporphyrine III de J. Waldenstrôm est encore un mélange d’uro-

porphyrine I et d’une porphyrine ;’i sept groupements carboxyles. O. Volker

(73) utilise la chromatographie sur alumine, dans son étude sur les porphy¬

rines des plumes des Oiseaux, pour séparer l’ester méthylique de la copro-

porphyrine III. Personnellement nous employons la technique ohroma-

tographiquo pour purifier et identifier les porphyrines des coquilles de

Mollusques (74) et les porphyrines de l’ambre gris (75). Signalons également

l’emploi de la terre d'infusoires par W. Grotepass et A. Défalqué (76) et du

Kieselguhr par C. Rimington (77).

A ces diverses techniques d’adsorption s'ajoute celle de la chromatogra¬

phie de partage sur papier, adaptée à l'étude des porphyrines par R. E. H.

Nicholas et C. Rimington (78, 79). Les meilleurs résultats sont obtenus

er > employant le système lutidine - eau en atmosphère ammoniacale. L’em-

placement des porphyrines sur la bande de papier dépend du nombre des

poupes carboxyliques libres, le Rf diminuant quand le nombre des fonctions

acides augmente. R. E. H. Nicholas et A. Comfort (80) viennent d’appli-

Source : MNHN, Paris

K. TIXlEIt

quer celte méthode à l'étude des porphyrincs des coquilles de divers Mol¬

lusques et de montrer qu’une coproporphyrine accompagne l’uroporphyrine

dans certaines espèces de Pinclada (Pleria ). R. Mac Swiney, R. E. H. Ni-

cholas et F. T. G. Prunty (81) l’emploient également dans l’étude de cas

de porphyric aiguë et décèlent l’existence de porphyrincs dont le nombre

de groupements acides est différent de celui des porphyrines connues.

Dans le domaine des pigments biliaires, l'analyse chroinatographiquc

permet à W. Siedel (82) de montrer que la mésobiliviolinc IXa était en

réalité un mélange de deux pigments isomères : l’un pour lequel cet auteur

conserve le terme de mésobiliviolinc, l’autre qu’il dénomme mésobilirho-

dine. W. Siedel étudie également l'isomérisation progressive de la méso-

bilivioline XHIa en <p mèsobilivioline XIII* (83), sépare les bilirubinoïdes

correspondant aux diverses phases de la réaction de Gmelin (mésobilipur-

purines et mèsocholétélinc) (84, 85) et purifie la mésobilifuscine (86). De

même H. Fischer (87) utilise l'adsorption chromatographique pour purifier

les esters méthyliques des bilivordines IXa et II la lors de la synthèse de

ces pigments. Au cours de recherches antérieures (88, 89, 28), nous indiquons

une méthode de purification de la biliverdine IXa et de son isolement h

partir des coquilles d’œufs d’Émeu. La possibilité d’une séparation de la

bilirubine par chromatographie est étudiée par T. K. With (90). K. Lederer

(60) utilise l’adsorption sur alumine, pour séparer les chromoprotéides des

sécrétions des Aplysies, et sur carbonate de calcium, pour isoler les groupe¬

ments prosthétiques de ces pigments (aplysiovioline et aplysiorhodine).

Signalons également le travail de E. Lederer (41) sur le pigment vert

de Bonellia viridis et celui de H. Willstaedt (91) sur les biochromes verts

des arêtes de Belone belone (Orphie) et de Zoarces viviparus.

Au cours du présent travail nous faisons constamment usage de l’analyse

chromatographique, tant pour l’isolement des porphyrines que pour celui

des pigments biliaires.

Dans la première partie de cet exposé nous étudions les porphyrines des

coquilles de Mollusques appartenant aux genres Pleria, Clanculus et Trochus,

puis les pigments biliaires des tests de Turbo et d 'Haliolis.

Dans la deuxième partie nous exposons les recherches effectuées sur les

porphyrines de l’ambre gris, concrétion intestinale du Cachalot (Plujseler

macrocephalus).

Source : MNHN, Paris

PIGMENTS TÉTKAPYRHOLIQUES

4 «

TECHNIQUES PERSONNELLES

Les techniques utilisées au cours de ce travail pour l’extraction, la puri¬

fication et l’identification des pigments porphyriniques ou biliaires (soit

à partir de l’ambre gris, soit à partir des coquilles de Mollusques) étant

extrêmement voisines, il nous semble intéressant de les résumer en un cha¬

pitre commun.

I. — EXTRACTION ET ESTÉRIFICATION DES PIGMENTS

Les porphyrines et les pigments biliaires sont extraits par de l’alcool

méthylique chlorhydrique à 10 ou 12 pour 100, préparé par passage de

gaz chlorhydrique dans le méthanol. Il est ainsi possible de dissoudre les

pigments, de les estérifier, puis de les faire passer dans un solvant organique

tel que le chloroforme. Cette méthode rend possible l’isolement des bio¬

chromes qui, directement, ne peuvent être dissous dans les solvants orga¬

niques.

C’est ainsi que les porphyrines de l’ambre gris ne peuvent être extraites

en totalité ni par les solutions alcalines ou acides, ni à l’aide des solvants

organiques ; seul, l’usage de l’alcool méthylique chlorhydrique permet de

dissoudre l’ensemble des porphyrines. Après distillation de la liqueur alcoo¬

lique sous vide, les pigments sont repris par le chloroforme. L’extraction

directe des porphyrines de la solution alcoolique par le chloroforme donne

en effet naissance à des émulsions difficiles à détruire.

De même, dans les recherches antérieures sur les pigments des coquilles

de Mollusques (Turbo, Troclius, Haliolis), il avait été constaté que ces bio-

chromes présentaient les réactions des bilirubinoïdes, mais qu’ils étaient

msolubles dans les solvants organiques. Les coquilles étaient attaquées

par des solutions acides diluées et les pigments, dissous dans les liqueurs

acides, ne pouvaient être enlevés par les solvants habituels des bilirubi¬

noïdes. L’emploi de l'alcool méthylique chlorhydrique permet de détruire

le substrat calcaire, de dissoudre les pigments, de les estérifier, puis de les

extraire par le chloroforme.

Cette méthode semble assez générale, c’est ainsi que le pigment (hélio-

porobiline) du Corail bleu (Heliopora cænilea) (14, 15) ne peut être dissous

par un solvant organique qu’après traitement par l’alcool méthylique chlo-

cfiydrique. Dans les cas où les pigments sont insolubles dans l’eau acide

Source : MNHN, Paris

R. TIXIEB

(biliverdine des coquilles d’œufs d'Émeu (89), pigment bleu d’ Heliopora),

il est possible d’attaquer le substrat calcaire par de l’eau chlorhydrique,

puis de reprendre le résidu par le méthanol chlorhydrique. Ce procédé n’est

cependant pas universel ; ainsi, la biliverdine des coquilles d’œufs d’Émeu

existe sous deux formes ; l’une fixée au calcaire, qui est dissoute par l’alcool

méthylique chlorhydrique, l’autre à l'état de chromoprotéide, qui ne peut

être séparée par ce moyen.

Pour que l’estérification des porphyrines et des pigments biliaires par

l’alcool méthylique chlorhydrique soit complète, la solution nettement

acide est laissée 24 heures à l’obscurité (en général après 0 heures l’estéri¬

fication est terminée). La durée de l'estérification peut être abrégée en

portant la solution à l’ébullition pendant 1/4 ou % heure.

Les porphyrines et les pigments biliaires sont en général extraits directe¬

ment par le chloroforme ou l’éther à partir de la solution alcoolique diluée

avec de l’eau distillée. Cependant dans certains cas les pigments ne peuvent

être eplevés par le chloroforme qu’après neutralisation de la liqueur acide

par du bicarbonate de sodium (pigments des coquilles de divers Turbo

et d ’llaliolis çrqcherodii), ces pigments éLant d’autant plus solubles dans

l’eau que la liqueur est plus acide-

Les porphyrines et les pigments biliaires sont des éléments amphotèreg,

possédant dans leur molécule à la fois des fonctions acides et basiques. Par

action de l’alcool méthylique chlorhydrique, les radicaux acides sont esté-

rifiés et les fonctions hasjques salifiées (chlorhydrates d’esters méthyliques).

Les chlorhydrates sont décomposés par lavages des solutions chlorofor¬

miques à l’aide d’une solution de carbonate de sodium à 5 %, L ! eau distillée,

employée pour les lavages des solutions chloroformiques, doit être exempte

de métaux lourds, et en particulier de cuivre, qui provoqueraient la forma¬

tion de sels complexes difficiles à détruire.

2. — PURIFICATION PAR CHROMATOGRAPHIE

Dans les recherches exposées au cours de ce travail, l’alumine est le seul

adsorbant utilisé au cours des chromalographies. Il est nécessaire d’employer

une alumine purifiée pour éviter la formation de sels complexes. Dans le

cas des pigments biliaires du groupe de la biliverdine, la formation des sels

complexes est immédiatement visible par virage au vert de la solution pig¬

mentée bleue. L’alumine commerciale utilisée est purifiée en employant

la technique préconisée par C, Sannié (92). L’alumine est tamisée, ppig

mise à macérer pendant 24 ou 48 heures dans de l’acide chlorhydrique

concentré et chaud. Elle est ensuiLe lavée à grande eau jusqu’à disparition

de l’acidité, puis séchée, et enfin calcinée au four électrique à 400° pendant

2 heures %, L’alumine ainsi traitée étant très active, il est nécessaire dans

certains cas de diminuer son pouvoir adsorbant par lavages à l’alcool méthy-

Source : MNHN, Paris

PIGMENTS TÉTBAPYBBOLIQÜES

îique (pigments des coquilles de Turbo). Dans nos dernières recherches,

nous avons utilisé des alumines purifiées plus ou moins désactivées, soit

par incorporation d’eau à l’alumine selon le procédé de P. B. Muller (93,

94), soit par humidification de l’alumine et standardisation à l’aide de colo¬

rants azoïques selon Içs techniques préconisées par H. Brockmann (95).

Les solvants employés pour la chromatographie sont, en général, purifiés,

Puis desséchés. Cependant, pour l’élution des pigments biliaires, |e chloro¬

forme technique donne de meilleurs résultats que le choroforme purifié et

desséché, ce dernier ne détermine la formation de zones colorées qu’après

addition d'un peu d’alcool méthylique.

Pour fixer les pigments sur la colonne d’alumine, nous employons des

mélanges de solvants ; le pigment est dissous dans un solvant approprié,

Puis la solution est additionnée d’un volume variable d’un autre solvant

dans lequel le pigment est insoluble. Pour développer le chromatogramme,

nous diminuons la proportion du solvant dans lequel le pigment est insoluble.

L est ainsi que pour chromatographier les porphyrines des coquilles de Pleria

toacroplera, les pigments sont dissous dans du chloroforme, puis la solution

est additionnée d’un égal volume d’éther dans lequel la porphyrine est

insoluble. Dans ces conditions, les porphyrines se fixent en haut de la colonne

d’alumine, tandis qu’un pigment jaune et des substances incolores s’élj-

Winent. Le chromatogramme est ensuite développé à l’aide d’un mélange

de deux volumes de chloroforme pour un volume d’éther.

Pour chromatographier les porphyrines de l’ambre gris, nous utilisons un

mélange de chloroforme et d’éther de pétrole selon une technique comparable

a celle indiquée par J. C. Watson et ses collaborateurs (71, 72). Pour les

P’gments biliaires, nous employons un mélange de chloroforme et d’éther

P ( »ur fixer les bilirubinoïdes, puis nous développons le chromatogramme à

I aide de chloroforme.

Lorsque les porphyrines sont en petites quantités et mélangées à d’autres

P’gments brun rouge, il est utile de suivre le développement du chrornato^

gramme aux rayons ultra-violets, afin de situer les zones porphyriniques.

Les pigments possédant des radicaux non saturés sont plus fortement adsor-

bés que ceux à structure fondamentale identique, mais à radicaux saturés.

L’est ainsi que la protoporphyrinc, qui possède deux groupes vinyle à la

place des radicaux éthyle de la mesoporphyrine, est plus fortepient adsorbée

fiae cette dernière et peut ainsi en être séparée.

Dans certains cas, nous sortons la colonne d’alumine du tube à chrorpa-

t°graphicr lorsque les zones sont nettement détachées, puis nous séparons

les zones pigmentées et nous éluons les pigments avec un solvant approprié.

Lepcndanl nous préférons en général employer la méthode du chromato-

geamme liquide, c’est-à-dire recueillir séparément les liquides colorés, qui

titrent lorsque les zones correspondantes atteignent respectivement le bas

‘le la colonne d’alumine.

Les pigments séparés par une première chrojnatographje sont purifiés

Source : MNHN, Paris

R. TIXIEB

par une nouvelle chromatographie sur alumine, puis recristallisés. La cris¬

tallisation des pigments est effectuée dans des mélanges de solvants, le

pigment est dissous dans un solvant approprié, puis la solution est additionnée

d’un égal volume de solvant dans lequel le biochrome est insoluble. C’est

ainsi que l’ester méthylique de l’uroporphyrine I, isolé des coquilles de Pleria

macropiera, est dissous dans du chloroforme, la solution chloroformique étant

ensuite additionnée d’acétate d’éthyle ; par évaporation spontanée, le pig¬

ment cristallise au sein du mélange en longues aiguilles rouges. Pour les

porphyrines de l’ambre gris, les pigments sont dissous dans quelques cm*

de chloroforme, puis la solution est additionnée d’un égal volume d'alcool

méthylique à chaud ; par refroidissement les porphyrines cristallisent. Le

pigment bleu des coquilles de Turbo cristallise au sein d’un mélange de chloro¬

forme et d’acétate d’éthyle.

3. — CARACTÉRISATION DES PIGMENTS

L’étude des spectres d’absorption des porphyrines et des pigments biliaires,

dans l’ullra-violet et dans le visible, est d’une grande utilité pour la carac¬

térisation de ces pigments ; en effet, si une telle étude ne peut suffire à la

détermination exacte du biochrome étudié, elle permet en général de le

ranger dans un groupe de pigments connus et d'avoir une idée de la structure

chimique fondamentale. C’est ainsi, par exemple, que tous les pigments

biliaires ayant une structure bila-triène possèdent des spectres d’absorption

comparables dans l’ultra-violet et le visible ; seules les positions des maxima

des bandes d’absorption diffèrent d’un pigment à l’autre, suivant la nature

des radicaux fixés sur les noyaux pyrroliques.

Au début de ce travail, l’étude des spectres d'absorption dans l'ultra¬

violet est réalisée à l’aide du grand spectrographe pour chimistes de Zeiss

à optique de quartz, avec un dispositif photométrique à secteur tournant.

Les maxima des bandes d’absorption sont précisés à l'aide du microphoto¬

mètre de Sannié (96). Les spectres dans le visible sont examinés avec le

spectrophotomètrc d’Yvon et Jobin. Dans les deux cas, les courbes d’absorp¬

tion sont établies en log. e. Au cours des dernières recherches, les spectres

sont étudiés à l’aide du spectrophotomètrc de Bcckman et les courbes

d’absorption données en e. Dans les divers cas les solvants employés sont

l’alcool absolu, le chloroforme et le dioxane.

L’emploi de la chromatographie permet de séparer des traces de pigments

pyrroliques dissimulés par d’autres biochromes plus abondants. Dans ce

cas, la quantité de pigment isolé par chromatographie étant trop faible pour

pouvoir être étudiée chimiquement, il est possible d'identifier le biochrome

à l’aide des spectres d’absorption, ainsi que par l’emploi de la chromato¬

graphie mixte. C’est ainsi que nous avons pu mettre en évidence des traces

d’uroporphyrine I dans des coquilles de Pleria margarili/era, de divers

Trochus et de Clanculus pharaonis.

Source : MNHN, Paris

PIOMENTS TÉTRAPYRROLIQUJiS

Lorsque la quantité de pigment isolé est suffisante, nous prenons le point

de fusion mixte, nous effectuons une chromatographie mixte et nous exami¬

nons les spectres d’absorption. Enfin, si le pigment obtenu est suffisamment

abondant, nous en effectuons l’analyse élémentaire.

Nous avons également employé la chromatographie sur papier pour préciser

le nombre de groupements acides contenus dans les pigments biliaires des

coquilles d’Haliotis cracherodii.

Nous devons signaler que le terme de biochrome, souvent employé au

cours de notre exposé, est préconisé par D. L. Fox (97) pour désigner les

pigments naturels.

Source : MNHN, Paris

B. T1XIEB

PREMIÈRE PARTIE

ÉTUDE DES PIGMENTS PYRROLIQUES DES

COQUILLES DE MOLLUSQUES

L’exposé sur les biochromes des coquilles de Mollusques se divise en deux

parties : l’une concernant les porphyrines, l’autre les pigments biliaires.

CHAPITRE PREMIER

ÉTUDE DES PORPHYRINES

Bien que les recherches sur les porphyrines fassent l’objet d’un travail

antérieur (28), nous en donnons un rapide aperçu, car il nous semble intéres¬

sant de rassembler dans un même ouvrage l’ensemble des connaissances

actuelles sur les pigments pyrroliques des coquilles de Mollusques.

A. — NOMENCLATURE

Les porphyrines sont des pigments, naturels ou synthétiques, possédant

quatre noyaux pyrrole reliés entre eux en position « par quatre ponts mé-

thènes — CH =. Elles dérivent toutes d’un même squelette : la porphine,

et se différencient les unes des autres par les radicaux fixés sur les carbones

en position (3 à la place des atomes d’hydrogène.

Source : MNHN, Paris

PIGMENTS TÉTRAPYIUIOLIQUES

L’une des porphyrines les plus simples est l’étioporphyrine qui ne contient

dans sa molécule que des radicaux méthyle et éthyle. Suivant la position

de ces radicaux, il est possible d’envisager l'existence de quatre isomères,

désignés par les chiffres romains I, II, III et IV. Il en est de même pour

les coproporphyrines et les uroporphyrines.

Pour la protoporphyrine, qui possède des groupements méthyle, vinyle et

Peopanoïque, il existe quinze isomères numérotés de I à XV. La protopor¬

phyrine naturelle est affectée du chiffre IX.

La réduction des radicaux vinyliques de la protoporphyrine IX en groupes

^hyle conduit à la mésoporphyrine IX.

B. — HISTORIQUE

En 1930, H. Fischer et K. Jordan (98) isolent des coquilles d’une Huître

Poi'lière (Pleria riuliula Lam.) un pigment rouge fluorescent : la concho-

porphyrine. Ils signalent en outre la fluorescence rouge des coquilles d 'Avicula

Source : MNHN, Paris

lenligenosa et A’A. caslanea. En 1932, H. Fischer et E. Haarer (99)

extraient le pigment fluorescent d’une autre espèce d'Huître, Pleria vulgaris

Schum., et l’identifient avec l’uroporphyrine I. Ce n’est qu’après de nom¬

breuses recherches synthétiques (100, 101, 102, 103, 104) et analytiques (66)

que H. Fischer et ses collaborateurs peuvent attribuer à l’uroporphyrine I

la formule suivante :

Finalement, H. Fischer conclut à l’identité de la conchoporphyrine avec

l’uroporphyrine I. En effet, les produits de dégradation de ces deux pigments

sont identiques et l’analyse chromatographique sur talc ne permet aucune

séparation des deux porphyrines mélangées. Récemment, A. Comfort (105)

examine la fluorescence en lumière ultra-violette d’un grand nombre de

coquilles, puis fait un exposé général sur les pigments des Mollusques (106)

et préconise l’emploi de leurs tests comme source pratique d’uroporphyrine I

(107). R. E. H. Nicholas et A. Comfort (80), appliquant l’analyse chroma-

Source : MNHN, Paris

PIGMENTS TÉTBAPYRROLIQUES

tographique sur papier à l’étude des porphyrines de divers genres, montrent

la présence de traces d’une coproporphyrine, à côté de l’uroporphyrine,

dans les coquilles de Pleria radiala et de P. vulgaris. En outre, ils signalent

l’existence d’une uroporphyrine dans les tests de Trivia europea, liulla sp.,

Placuna cella, Umbonium australe, Malleus vulgaris et Gibbula cineraria.

C. — RECHERCHES PERSONNELLES

I. PORPHYRINES DES COQUILLES DE PTÉRIDÉS

Les Ptéridés sont des Mollusques Bivalves Anisomyaires appartenant

au groupe des Ptériacés. Nous avons étudié deux exemplaires de Pleria

(= Avicula) rnacroplera Lmk et une valve de P. margarili/era L. Les coquilles

de P. rnacroplera provenaient de Zanzibar ; leur surface externe brunâtre

et plus particulièrement les bords noirâtres de la face interne montraient une

nette fluorescence rouge en lumière ultra-violette. Par contre, la coquille

de P. margarilijera ne présentait aucune fluorescence. La teneur en por¬

phyrine des coquilles de P. rnacroplera étant relativement élevée, nous avons

Pu en faire une étude détaillée.

a) PRÉPARATION

1° Extraction et estérification des pigments.

Nous n’insisterons pas sur la technique d’extraction des pigments fluo¬

rescents, l’ayant déjà mentionnée en détails antérieurement (28). Les

c °quilles sont attaquées par de l’alcool méthyliquc chlorydrique à 10 pour 100,

fui dissout et estérifie la porphyrine. La solution alcoolique rouge brun,

fluorescente, est reprise par du chloroforme et de l’eau distillée. Finalement

a couche chloroformique décantée est lavée avec une solution de carbonate

de sodium à 5 pour 100, puis concentrée sous vide.

~° Isolement et purification de la porphyrine par chromatographie.

Les travaux de J. C. Watson et de ses collaborateurs (71, 72) sur la chro¬

matographie des uroporphyrines n’étaient pas connus en France lorsque nous

av ons entrepris ces recherches. La technique proposée donne d’excellents

résultats pour la séparation et la purification de l’uroporphyrinc I.

Chromatographie de la porphyrine de Pleria rnacroplera.

La solution chloroformique, additionnée d’un égal volume d’éther

“«hydre, est filtrée sur une colonne d’alumine. Les pigments se concentrent

* a partie supérieure de la colonne en une couche grisâtre à l’intérieur de

,a quelle apparaît une zone rougeâtre. En outre un pigment jaune peu abon-

•Mkmoirks du MusSuh, Zoologie, L V. S

Source : MNHN, Paris

K. T1X1ER

dant s’élimine à travers la colonne. La zone rougeâtre fluorescente est ensuite

détachée de la couche grisâtre supérieure à l’aide d’un mélange de deux

volumes de chloroforme pour un volume d’éther anhydre (fig. 1, a). Cette

zone nettement délimitée chemine jusqu’en bas de la colonne ; nous recueil¬

lons le solvant qui filtre en entraînant le pigment rouge. A la suite de cette

zone rouge se détache un anneau rouge violacé à fluorescence orange ; la

couche grisâtre, demeurant à la partie supérieure de la colonne d’alumine,

ne présente plus aucune fluorescence.

La solution chloroformique rouge à fluorescence rouge intense présente

le spectre à cinq bandes, caractéristique des porphyrines neutres. Le pig¬

ment de l’anneau rouge violacé n’étant obtenu qu’en très faible quantité,

nous ne poursuivons pas son étude.

v/ym

t.grisâtre

z .orange

nui

Par évaporation spontanée de la solution chloroformique rouge, la por-

phyrine cristallise en longs et fins cristaux rouges, courbes, enchevêtrés.

Ces cristaux sont lavés avec un peu d’acétate d'éthyle qui enlève des traces

de pigment orangé. Finalement, après une nouvelle chromatographie, la

porphyrine est recristallisée au sein d’un mélange chloroforme-acétate

d’éthyle. Des deux coquilles de Pleria mucroplera nous avons extrait 22 mg.

d’ester méthylique de la porphyrine.

Chromatographie de la porphyrine de Pleria margarilifera.

L’analyse chromatographique est conduite selon la technique précédente.

Le développement à l'aide du mélange de deux volumes de chloroforme pour

un volume d’éther permet de séparer un anneau rose à fluorescence rouge,

ainsi qu'une zone orange à fluorescence orange (fig. 1, b). La solution chlo¬

roformique rose, recueillie lorsque la zone à fluorescence rouge atteint le

bas de la colonne d’alumine, présente le spectre d’absorption des porphy¬

rines. La teneur en porphyrine des coquilles de Pleria margarililera étant

trop faible pour pouvoir tenter l’isolement de ce biochrome, nous avons dû

nous contenter d’en faire un examen spectroscopique.

Source : MNHN, Paris

PIGMENTS TÉTRAPYRR0LIQUE8

b) PROPRIÉTÉS

1° Porphyrine de Pteria macroptera.

Isolé sous forme de longues el fines aiguilles rouges, l’ester méthylique

de la porphyrine de Pleria macroplera fond au bloc de Maquenne à 295° ;

ce point de fusion est analogue à ceux des esters méthyliques de l'uropor-

phyrine I (293°) (108). Signalons cependant que H. Fischer et H. F. Hof-

mann (66) situent le point de fusion de l’ester méthylique de l’uroporphy-

ri ne I, purifié par chromatographies sur talc, à 301°, tandis que M. Grins-

tein et ses collaborateurs (72), après chromatographie sur carbonate de

calcium, indiquent pour ce pigment un point de fusion de 284° et prétendent

que les variations des points de fusion plus élevés sont dues à une saponi¬

fication partielle ou à la présence de complexes métalliques.

Comme l’ester méthylique de l’uroporphyrine I, le pigment de Pleria

macroplera est très soluble dans le chloroforme, insoluble dans l’éther, l’acé¬

tate d’éthyle et l’acide acétique pur ou dilué.

La teneur en G, H, N s’accorde avec la formule élémentaire (J^ i 1 M t) M N 4 ,

fiui est celle des esters méthyliques des uroporphyrines.

Prise d’essai CO # H,0

en mg. en mg. en mg.

3,381 7,555 1,777

C % H %

Trouvé. 60,97 5,88

Calculé. 61,13 5,77

Le dosage de l'N, effectué selon la microméthode de Dumas, indique une

teneur de 5,83 pour 100, le taux d’N des esters méthyliques des uropor-

Pfiyrines est de 5,95 pour 100.

Spectre dans l'ullra-uiolet.

Les solutions porphyriniques présentent à la limite du visible et de l’ultra-

v iolet une bande d’absorption dont le maximum se situe aux environs de

'• 400 ; nous avons observé, pour le pigment de Pleria macroptera en

solution chloroformique, un maximum d’absorption à X 408(1 m.

Spectre dans le visible.

Les maxima trouvés avec la solution chloroformique de l’ester méthylique

fi ,! la porphyrine de Pleria macroptera se situent à : IX 625 mp ; la X 600 m(i ;

Il X 570 ni|i ; 111X532 m(i ; IV X500ni|i. Ils sont entièrement comparables à

ceux des esters méthyliques des uroporphyrines : I X 624 nijt ; la X 597 m^ ;

11 >■ 569 m,i ; III X 531 m^ ; IV X 499 m^ .

Sel complexe de cuivre.

Cristallisé en fines aiguilles rouge vif, courbes, souvent réunies en amas

Source : MNHN, Paris

U. TIXIER

(aspect de gerbes), le sel complexe de cuivre de la porphyrine de Pleria macrop-

lera fond à 345-346°. Le point de fusion du sel complexe de l’uroporphy-

rine I est de. 346-348° (109). L’un et l’autre sont solubles dans le chloro¬

forme, insolubles dans l’acétate d’éthyle et l'acide acétique. Leurs spectres

dans le visible sont identiques ; leurs courbes d’absorption présentent en

eiïet deux maxima situés, l'un à X 565 m^ , l’autre à X 528 m^ .

2° Porphyrine de Pteria margaritifera.

La solution chloroformique rose à fluorescence rouge de la porphyrine

de Pleria margarililera présente quatre bandes d’absorption, dont les maxima

correspondent exactement à ceux que nous avons observés avec l’ester méthy-

lique de l’uroporphyrine de P. macroplera : I >. 625 m^ ; II X 570 ny ;

III X 532 m,*; IV X 500 m,* .

c) CONCLUSION

Malgré de nombreuses cristallisations, H. Fischer n’a pu obtenir la por¬

phyrine (conchoporphyrine) de Pleria radiala à l’état pur, et ce n’est qu'après

de nombreuses années de recherches qu’il a finalement identifié cette por¬

phyrine avec l’uroporphyrine I, grâce à l’étude de ses produits de dégrada¬

tion et à l’emploi de la chromatographie sur talc. Par contre la porphyrine

des coquilles de P. vulgaris n’étant pas souillée par d’autres substances

colorées, H. Fischer l’a identifiée facilement avec l’uroporphyrine I. La

technique de chromatographie sur alumine, que nous venons d’indiquer,

rend aisé l’isolement et la purification des porphyrines des coquilles de Mol¬

lusques, lorsqu’elles sont accompagnées de nombreuses impuretés.

Par son aspect cristallin, son analyse élémentaire, ses spectres et ses solu¬

bilités, la porphyrine de P. macroplera s’apparente aux uroporphyrincs.

Par son point de fusion et par celui de son sel complexe de cuivre, elle s’iden¬

tifie avec l’uroporphyrinc I. Au cours de la chromatographie, nous n’avons

pas décelé la présence de l’uroporphyrine 111 qui accompagne généralement

l’uroporphyrine I dans les cas de porphyrie.

L’analyse chromatographique permet de mettre en évidence des traces

d’uroporphyrine I dans les coquilles de P. margarililera. Il semble ainsi que

la présence d'uroporphyrine I dans les tests des Ptéridés soit un fait général.

Dans certaines espèces (P. macroplera, P. vulgaris, P. radiala), la proportion

d’uroporphyrine I est relativement importante, alors que dans d’autres

espèces (P. margarililera) elle n’existe qu’à l’état de traces. L’existence d’une

coproporphyrine, signalée par R. E. H. Nicholas cL A. Comfort, dans les

coquilles de P. radiala cL P. vulgaris est, par contre, inconstante et de faible

importance.

Source : AANHN,,

PIGMENTS TÉTRAPYBROLIQUES

II. PORPHYRINES DES COQUILLES DE TROCHIDÉS

Rappelons que les Trochidés sont des Mollusques Gastéropodes Proso-

branches du groupe des Trochacés. Nous avons examiné les pigments des

coquilles de Clanculus pliaraonis, de Troclius virgalus et de T. maculalus.

a) PRÉPARATION

La coquille de Clanculus pliaraonis L., rouge corail avec des granulations

noires et blanches, montre en lumière ultra-violette une fluorescence rouge

sombre ; les coquilles de Troclius virgalus Gmclin et de T. maculalus L.

présentent des taches roses ou brunâtres.

Les pigments de ces divers Trochidés sont extraits selon la technique

mdiquée antérieurement. Le comportement chromalographique de leur

Porphyririe est identique à celui de l’uroporphyrine I de Pleria macroplera.

Dans le cas des coquilles de Clanculus, la porphyrinc cristallise en longues

aiguilles fines, réunies en amas feutrés (aspect de touffes de cheveux des

Uroporphyrincs).

b) PROPRIÉTÉS

La porphyrine des coquilles de Clanculus pliaraonis est soluble dans le

chloroforme, insoluble dans l’éther. Le spectre de sa solution chloroformique

est superposable à celui de l’ester méthylique de l’uroporphyrine de Pleria

macroplera : I X 625 ny ; II X 572 ny ; III X 532 ny ; IV X 500 ny. Enfin

une chromatographie sur alumine d’un mélange des deux porphyrines ne

donne lieu à aucune séparation des pigments.

Les solutions chloroformiques roses obtenues avec les coquilles de Tro-

chus ont également des spectres d’absorption superposables à celle de l’uro-

Porphyrine de Pleria macroplera : I X 625 ny ; II X 572 ny ; III X 533 ny ;

IV X 500 ny .

La quantité de porphyrine que renferment les coquilles des Trochidés

e »t trop faible pour pouvoir tenter l’isolement et l’étude plus complète de

c e pigment.

c) CONCLUSION

Nous avons obtenu à l'état cristallisé la porphyrine des coquilles de Clan-

culus pliaraonis et montré la présence d’une porphyrinc dans les coquilles

6e Trochus virgalus et de T. maculalus. Ces diverses porphyrines de Tro¬

chidés ont un comportement chromatographique analogue à celui de l’uro-

porphyrine de Pleria macroplera ; leurs spectres d’absorption sont égale-

roent identiques. Certaines coquilles de Troclius possèdent un pigment

Ver L présentant les caractères d’une bilivcrdinc ; il aurait été intéressant

de pouvoir isoler ce bilirubinoïde et de comparer ses propriétés à celles de

Source : MNHN, Paris

02 R. TIXIER

biochromes des tests de Turbo et d 'Haliolis. Nous n'avons pu malheureu¬

sement nous procurer le matériel nécessaire pour cette étude.

Enfin, l’observation de ces divers Mollusques à l’état vivant permettrait

de rechercher l’origine de l’uroporphyrine I et de voir s’il s’agit d’un pro¬

duit de dégradation ou plutôt de biosynthèse.

CHAPITRE II

ÉTUDE DES PIGMENTS BILIAIRES

A. — NOMENCLATURE

Afin de rendre plus compréhensible l’exposé du présent travail, il nous

parait utile de dire quelques mots sur la nomenclature et les propriétés géné¬

rales des pigments biliaires. C’est surtout grâce aux nombreuses recherches

analytiques et synthétiques de H. Fischer et de W. Siedf.l que la consti¬

tution chimique de ces pigments naturels, provenant principalement de

la destruction de l’hémoglobine, est actuellement bien connue.

La nomenclature employée pour désigner les pigments biliaires doit

tenir compte des porphyrines correspondantes. C’est ainsi qu’il existe quinze

isomères possibles de la protoporphyrine, numérotés de 1 à XV, distincts

les uns des autres par les positions respectives des radicaux méthyliques,

vinyliques et propanoïques des noyaux pyrroliques. Les pigments biliaires

naturels, dérivant de la protoporphyrine IX, seront affectés du chiffre IX.

En outre, il est nécessaire de signaler l’endroit où se produit la rupture du

Source : MNHN, Paris

PIGMENTS TÉTBAPYBROUQÜES

«3

cycle pnrphyrinique, cotte ouverture pouvant avoir lieu aux ponts «,

y ou 5. Les pigments biliaires dérivant de la protoporphyrine IX par rupture

au cycle porphyrinique au pont « seront affectés du signe IX«.

Bilirubine IX«.

Signalons que le terme de pigments biliaires tend à désigner les pigments

Pyrroliques naturels provenant de la dégradation du groupement prosthé¬

tique de l’hémoglobine et possédant quatre ou seulement deux noyaux pyrro-

Hques, l’expression bilirubinoïdes étant réservée aux dérivés tétrapyrroliques

naturels ou synthétiques.

La numération, adoptée par H. Fischer (110) et par W. Siedel 111),

est indiquée dans le schéma suivant :

Elle va de 1 à 8 pour les substitutions en position (3 et de 1’ à 8’ pour

celles en position «. R. Lemberg (19) propose, pour éviter toute confusion

avec les groupes méthènes (a, |3, y, 5) des porphyrincs, d’adopter pour

désigner les ponts carbonés des bilirubinoïdes les lettres a, b, c.

Les bilirubinoïdes variés, isolés des diverses sécrétions ou excrétions

de l’organisme humain, proviennent d’une réduction plus ou moins complète

de la biliverdine IX«. Ces pigments doivent leurs propriétés générales et en

particulier leur couleur, non aux radicaux fixés sur les noyaux pyrroliques

en position (3, mais à la présence et h la distribution des doubles liaisons des

Ponts carbonés. C’est ainsi qu’à la réduction de toutes les doubles liaisons

correspond la disparition de la couleur (mésobilirubinogène, stercobilinogène).

H H H H

Mésobilirubinogène IXa.

La présence d’une double liaison étant signalée par le suffixe ène, la dési¬

gnation Iriine indiquera la présence de trois doubles liaisons. Pour montrer

Source : MNHN, Paris

K. TIXIER

qu’il s’agit d’un bilirubinoïde, les auteurs allemands emploient le préfixe

bili-, auquel R. Lemrerg substitue celui de bila-. Ainsi la biliverdine, qui

"0-

-O—-O-

-Ç"

Structure bila-diène (a, b).

possède trois doubles liaisons, a une structure bili- ou bila-triène. La position

des doubles liaisons est précisée à l’aide des lettres désignant les ponts

— 0 —^— 0 —™—” 0 ™

” N H H »

H H

Structure bila-diène (a, e).

carbonés. Ainsi la bilirubine a une constitution bila-diène (a, c) et la méso-

bilivioline une structure bila-diène (a, b).

hoQ— a. —n— m —n — <■—n*

O U i; j; t;

Structure bila-triène.

Les pigments, qui possèdent une constitution bila-triène, sont bleus,

leurs spectres d’absorption dans l’ultra-violet et dans le visible sont analogues,

leurs sels de zinc sont verts, ils donnent avec l’acide nitrique nitreux les

phases violette, rouge, orange et jaune de la réaction de Gmelin ; leurs sels

de zinc, après oxydation par l’iode, deviennent bleus et présentent une intense

fluorescence rouge ainsi qu’un spectre caractéristique. R. Lemberu désigne

ces pigments sous le nom générique de verdines. Les bilirubinoïdes qui

présentent des propriétés analogues à celles de la bilirubine constituent la

classe des rubines, tandis que les pigments dont les caractéristiques sont

semblables à celles de la mésobiliviolinc font partie des oiolines.

Biliverdine IX».

f Cependant, si à une même structure correspondent des spectres analogues,

les positions des maxima des bandes d’absorption dépendent des radicaux

Source : MNHN, Paris

PIGMENTS TÉTRAPYRROLIQUES

fixés sur les noyaux pyrroliques. C’est ainsi que la biliverdine et la mésobi-

Üverdine (ou glaucobiline), qui possèdent, l’une et l’autre, la structure bila-

Wène, mais qui diffèrent par la présence de deux groupes vinyliques dans la

première, remplacés par deux radicaux éthyliques dans la seconde, ont

COCU! HOOÇ

V F—I e A % c f =. c =%

H J- -CH- Il II -CH_l J -CH- 1 JOH

H H N N

Glaucobiline IXa.

d es traxima d’absorption distincts, aussi bien dans l’ultra-violet queTdans

visible (88).

line étude historique et une description détaillée des pigments biliaires,

ainsi qu’un aperçu de leur distribution dans les règnes animal et végétal

8 °nt donnés par R. Lemberg et J. W. Legge dans leur livre : « Hcmatin

compounds and Bile Pigments » (19).

B. — HISTORIQUE

La présence de pigments biliaires dans les coquilles de divers Mollusques

appartenant aux genres : Haliolis, Turbo et Trochus est signalée pour la

Première fois par C. Fr. Krukenberg en 1883 (112). Les résultats obtenus

Par cet auteur sont confirmés quelques années plus tard par F. N.

bCHUtz (113). Alors que les pigments d 'Haliolis donnent lieu à un certain

Nombre de recherches nouvelles, ceux des coquilles de Turbo ne font l’objet

d’aucun travail récent.

Attaquant les coquilles de diverses espèces de Turbo (T. olivaceus, T.

ra dialus, T. pelholalus) par de l’acide acétique ou de l’acide chlorhydrique

d*lué, C. Fr. Krukenberg obtient des solutions vertes ne présentant pas de

8 pectre d’absorption et donnant la réaction de Gmelin. Ce pigment, qui

Contre de grandes analogies avec la biliverdine, s’en distingue par le fait

Jl u d ne peut être extrait des solutions acides ni par le chloroforme, ni par

l’éther.

Par ailleurs, à partir des coquilles de Turbo sarmalicus et de T. ruyosus,

L- Fr. Krukenberg obtient un pigment, la turbobruninc, qui donne avec

alcool chlorhydrique une couleur rouge pourpre et qui, dans certaines

c °nditions, se transforme en pigment vert. En 1947 nous avons présenté

Une n °fe préliminaire (114) sur les propriétés du pigment bleu des coquilles

de Turbo Heyenfussi.

Les coquilles d’Haliolis, dont la pigmentation a attiré l’attention des

chercheurs, sont tantôt rouges [H. rufescens), tantôt bleu foncé (H. giganlea,

californiensis).

Source : MNHN, Paris

R. TIXIER

Le pigment deB coquilles d ’Haliolis rufescens est étudié par C. Fr. Knu-

kenberg (112), puis par F. N. Schulz (113). Après destruction du substrat

calcaire, le pigment rouge, dissous dans l’alcool ou l’eau acidulée, présente

les réactions des pigments biliaires ; il donne en particulier la réaction de

Gmelin, celle d’Erlich et, après réduction avec l'amalgame de sodium,

celle de l'urobiline. Cependant l’insolubilité de ce pigment dans les solvants

organiques et le comportement des spectres le distinguent nettement des

biochromes de la série bilirubinique.

Cette étude est reprise en 1930 par Ch. Dhéré et C. Baumeler (117, 17).

Les réactions et les spectres du pigment (rufescine) en solution aqueuse

neutralisée ou alcoolique acide sont soigneusement analysés ; l’action des

acides, des bases et des oxydants donne naissance à des produits de colo¬

ration variée (haliotirubine, haliotiverdine, halioticyanine) ; les uns possèdent

des spectres distincts de ceux des biochromes bilirubiniques, d’autres par

contre présentent des analogies évidentes avec les produits d’oxydation

de la bilirubine (bilicyanine, cholétéline).

Bien qu’ayant rapproché, dans son premier mémoire (112), le pigment

bleu (l'Haliolis californiensis des bilirubinoïdes, F. N. Schulz, dans un travail

ultérieur (118), le compare à l’indigo. H. Lemberg (119), reprenant cette

étude, réfute cette seconde hypothèse et réussit, en traitant la poudre de

coquilles par un mélange d’alcool absolu et d’acide chlorhydrique concentré,

à obtenir un produit présentant les solubilités dos esters des pigments biliaires.

Cet auteur sépare, grâce à leurs solubilités différentes dans l'acide chlorhy¬

drique dilué, deux pigments qui, en solution chloroformique acide, sont l’un

vert (pigment A), l’autre bleu-vert (pigment B). Ces biochromes ne pré¬

sentent aucune analogie de spectres avec les pigments biliaires connus,

leurs sels de zinc, ne montrent aucune fluorescence.

Signalons également le travail de T. Kodzuka ( 120) concernant le pigment

bleu-vert d ’Haliolis yiyanlea. Après réduction du pigment à l’acide iodhy-

drique et d'iodure de phosphonium, cet auteur observe la réaction des

copeaux de pin caractéristique du noyau pyrrolique.

Après avoir fait un bref exposé sur le pigment principal (haliotivioline)

des coquilles d 'H. craeherodii à la séance du 23 juillet 1948 du XIII e Congrès

International de Zoologie (Paris), nous publions une note préliminaire sur

la parenté de ce biochrome avec les bilirubinoïdes (121).Entre temps, A. Com¬

fort (122) considère de nouveau le pigment bleu d 'II. craeherodii comme un

dérivé de l’indigotine. Les arguments invoqués par A. Comfort sont, d’une

part, l’analogie entre les spectres d’absorption dans le visible du produit

d’oxydation du pigment principal d 'H. craeherodii et de l’uroroséine et,

d’autre part, la similitude entre les spectres dans l'ultra-violet du pigment

bleu d'Haliolis et de l’indigotine. Durant un bref séjour â l'Institut de Biologie

physico-chimique, A. Comfort prend connaissance de nos recherches, puis,

au cours d’une note récente (123) sur un biochrome jaune d 'H. craeherodii.

il reconnaît la nature tétrapyrrolique du pigment principal bleu.

PIGMENTS TÉTBAPYRROÏJQTJES

«7

C. — RECHERCHES PERSONNELLES

I. — PIGMENTS BILIAIRES DES TURBINIDÉS

Les Turbinidés sont des Mollusques Gastéropodes Prosobranches. Leurs

coquilles sont turbinées, lisses ou rugueuses, avec une ouverture arrondie,

ovale ou subtétragonale. La surface extérieure est plus ou moins pigmentée,

alors que la surface interne de la coquille est nacrée.

A. — Pigments biliaires des coquilles de Turbo liegenfussi Desh.

Les exemplaires mis à notre disposition provenaient de Nha Trang (Indo¬

chine). Une croûte calcaire recouvrait et protégeait la surface pigmentée.

a) PRÉPARATION

1° Extraction et estérification des pigments.

30 coquilles (5 kg. environ) de Turbo liegenfussi sont traitées par 8 litres

d'alcool méthylique chlorhydrique à 13 pour 100. Très rapidement la liqueur

alcoolique se colore en brun, puis en vert. Après 24 heures les coquilles,presque

entièrement décolorées, ne présentent plus que quelques zones bleues. La

solution alcoolique acide est traitée par fractions de 2 litres, chaque fraction

^tant additionnée de 500 cm’ de chloroforme, puis d’eau distillée jusqu’à

formation d’un trouble blanchâtre. Au cours de la neutralisation à l’aide

de bicarbonate de sodium, le chloroforme se sépare en entraînant les pig¬

ments. La couche chloroformique bleu-vert est ensuite décantée, puis lavée

successivement 3 fois à l’eau distillée, 2 fois avec une solution de carbonate

de sodium à 5 pour 100, puis de nouveau à l’eau distillée. Les pigments

biliaires, ayant leurs fonctions acides estérifiées, ne sont pas enlevés parla

solution alcaline, qui décompose uniquement les chlorhydrates formés en

milieu acide. Finalement les solutions chloroformiques provenant des diverses

^actions sont réunies, puis déshydratées à l’aide de sulfate desodium anhydre.

2° Purification et séparation des pigments par chromatographie.

Chromatographie à t'aide d’un mélange élhéro-chloroformique.

Après filtration, la solution chloroformique est évaporée à sec et le résidu

ost repris par un mélange à volumes égaux de chloroforme et d’éther ; les

Pigments bleu-vert sont ainsi dissous et débarrassés d’un résidu brunâtre

fondant. La solution éthéro-chloroformique est alors filtrée sur une colonne

d’alumine désactivée, qui fixe les pigments bleu-vert dans sa portion supé-

r,e Urc, tandis que le filtrat, jaune au début, devient rapidement incolore,

h-e chromatogrammc est, alors développé à l’aide de chloroforme technique

2, a). Une première zone bleu pâle se détache et descend rapidement,

suivie d’une zone principale bleu foncé nettement séparée de la première

Source : MNHN, Paris

It. TIXIEH

par un espace incolore. En haut de la colonne d’alumine demeure une zone

brun verdâtre. Les liquides colorés, qui filtrent lorsque les zones bleues

atteignent successivement le bas de la colonne d'alumine, sont recueillies

séparément.

Par évaporation spontanée de la solution chloroformique bleue, corres¬

pondant à la zone I, nous n’obtenons aucun produit cristallisé. Ce pigment

étant en trop faible quantité pour être étudié, nous nous sommes contenté

d’en prendre les spectres d’absorption, qui sont d’ailleurs identiques à ceux

du pigment de la zone principale (zone II).

a b

FM. 2.

z.II bleu foncé

I bleu pâle

;.IV brunâtre

: .III bleu pâle

z.II bleu foncé

.1 bleu pâle

Par évaporation de la solution chloroformique, bleue correspondant à la

zone principale, le pigment cristallise sous forme de prismes bleu foncé réunis

on houppes. Ce pigment est rechromatographié sur alumine, puis recristallisé

dans un mélange de chloroforme et d’acétate d'éthyle. Nous obtenons

ainsi 20 mg. de pigment à l’état d’ester méthylique.

Chromatographie à l’aide d’un mélange d'acêlale d’élhgle et d'élher.

A la suite d’une autre extraction à partir de 8 coquilles de Turbo Regenfussi

nous avons employé pour la chromatographie un mélange à volumes égaux

d’acétate d’éthyle et d’éther. Les pigments dissous dans ce mélange sont

fixés sur la colonne d’alumine. Le chromatogramme est alors développé à

l’aide d’acétate d’éthyle pur (fig. 2, b).

Comme dans l’expérience précédente, nous distinguons une première

zone bleu pâle suivie de la zone principale bleu foncé (zone II). En outre,

une troisième zone bleu pâle se détache de la zone supérieure (zone IV)

brune. Le pigment de la zone III esL en trop faible quantité pour pouvoir

être étudié. Nous pensons que ces différentes zones bleu pâle correspondent

à des pigments isomères du pigment principal.

Le filtrat correspondant à la zone principale est recueilli, puis rechroma¬

tographié selon la technique précédente. Le pigment est finalement rccris-

tallisé dans un mélange d'acétate d’éthyle et de chloroforme. Nous obtenons

ainsi 3 à 4 mg. de pigment cristallisé.

Source : MNHN, Paris

PIGMENTS T ÉTBAP Y K RO LIQU ES

b) PROPRIÉTÉS

Le pigment cristallisé, que nous proposons de nommer turboglauco-

biline, est très soluble dans le chloroforme, moins soluble dans l’acétate

d’éthyle et l'alcool méthylique, très peu soluble dans l’éther, insoluble dans

l’éther de pétrole ; ces solubilités correspondent à celles des esters méthy-

liques des pigments biliaires.

Son point de fusion, pris au bloc de Maquenne, est de 205°-206°. Nous

avons observé des points de fusion identiques pour les deux produits chro-

malographiés différemment.

L’analyse élémentaire (effectuée au Laboratoire du Muséum) nous a

fourni les résultats suivants :

1° pour C et H :

Prise d’essai

H,0

CO,

en mg.

3,841

2,14

8,37

2,882

1,63

6,31

C %

H %

59,46

6,22

59,72

6,31

J (dosage effectué selon la microméthode de Oui

Prise d’essai Volume d’N

N %

en mg.

en cm®

24°

— 761 mm.

4,725

0,325

7,52

es groupements méthoxylc :

Prise d’essai

I Ag

OC 11, %

en mg.

2,848

4,096

18,8

Nous donnons à titre comparatif la teneur en éléments des esters méthy-

l'ques de quelques pigments biliaires du groupe de la biliverdine, dont la

Lirboglaurobiline présente toutes les propriétés.

Lsters méthyliques

H %

N %

OC H, %

l'urboglaucobiline. . . .

. . . 59,46

6,22

7 52

18,8

59,72

6,31

Coproglaucobiline. . . .

. . . 64,08

6,35

7,67

16,99

Biliverdine.

. . . 68,85

6,22

9,17

10,16

Olaucobiline.

. . . 68,4

6,84

9,12

10,09

Source : MNHN, Paris

U. TIXIER

La turboglaucobiline possède une constitution chimique différente de celle

de ces divers pigments ; cependant les formules élémentaires, qui doivent

être retenues pour la turboglaucobiline, ainsi que nous le verrons plus

loin, sont voisines de celle de l’ester méthylique d’une coproglaucobiline :

Coproglaucobiline I.

*-'86* *46^«>N 4 dont elles se différencient principalement par la présence de

2 à 3 atomes d’oxygène supplémentaires dans leur molécule.

Les formules élémentaires, s’accordant avec les valeurs analytiques trou¬

vées pour nos préparations de turboglaucobiline, sont les suivantes :

C %

Calculé

H %

N %

WW> m n 4 .

.59,63

6,12

7,73

•8«H 48 0i a N 4 .

.59,47

6,38

7,70

;„h„o„n,.

.60,29

6,02

7,60

'37^46^12^4.

.60,19

6,27

7,58

.60,93

5,92

7,48

.(10,77

6,18

7,52

.59,50

6,05

7,30

.61,38

6,08

7,34

•39^46* , 13-^4.

.60,14

5,95

7,19

Toutes les propriétés de la turboglaucobiline s’accordent avec une structure

fondamentale bila-triène (voir p. 64), à laquelle correspond la formule

C 18 H # 0*N 4 ; en outre, d’après la teneur en méthoxyle et l’analyse chromato-

graphique sur papier, elle renferme 4 groupes carboxyle estérifiéssoit C 8 H ia O g ;

il ne reste plus sur les noyaux pyrroliques que 4 emplacements disponibles

pouvant être occupés par des radicaux — CH S soit C 4 H U , les carbones supplé¬

mentaires ne pouvant être liés au maximum qu’à 2 hydrogènes. Ces divers

éléments étant additionnés nous trouvons :

C w H 6 0iN 4 -f C 8 H u O g + C 4 H u = C 31 ll 80 O 10 N 4

Ce total étant soustrait des formules pouvant être envisagées pour la

turboglaucobiline, on s’aperçoit que seules les formules : CjgH 44 0 12 N 4 ,

C 3B H 46 0 i 8 N 4 et C 89 H 46 0 18 N 4 , pour lesquelles il reste respectivement C 7 H 14 O a ,

C 8 H 18 O a et C 8 H 16 0 3 , peuvent être retenues ; les autres formules renferment

en effet trop d’hydrogène par rapport au nombre d’atomes- de carbone.

Pour les formules Cggl I 44 O ïa N 4 et C n H 48 O u N 4 les teneurs en C sont voisines

Source : MNHN, Paris

PIGMENTS TÉTRAPYBROLIQÜES

de celles trouvées pour la lurboglaucobiline, par contre les teneurs en H et N

sont faibles ; pour la formule C 3B H 46 0 12 N 4 la teneur en G est trop élevée,

par contre les teneurs en H et N se rapprochent davantage de celles trouvées

pour la turboglaucobiline.

Réaction de Gmelin.

La turboglaucobiline, en solution chloroformique, donne avec l’acide

nitrique nitreux les phases violette, rouge, orange et jaune de la réaction

de Gmelin. Elle correspond en effet, comme la biliverdine, à la phase bleue

de la réaction de Gmelin.

Réaction iodo-zincique.

L’addition d’une liqueur alcoolique d’acétate de zinc à la solution chloro¬

formique de la Lurboglaucobiline provoque la formation d’un sel complexe

Ve rt. La solution verte ainsi obtenue ne présente pas de spectre caractéris¬

tique, mais seulement une forte absorption dans le rouge. Cependant, oxydée

par l’iode, cette solution devient rapidement bleue et présente alors une

■utensc fluorescence rouge et un spectre à deux bandes d’absorption. Cette

réaction, caractéristique des pigments biliaires ayant une structure bila-triène,

est due à la formation de produits d’oxydation (mésobilipurpurines dans le cas

de la glaucobiline) dont les sels complexes de zinc bleus offrent une intense

fluorescence rouge et un spectre à deux bandes d’absorption.

Spectre d'absorption dans l’ultra-violet.

L’examen du spectre d’absorption dans l'ultra-violet de la solution

Fig. 3. — Courbes d’absorption de l’ester m&liylique de la turboglaucobiline

dans l’ultra-violet et le visible.

chloroformique de la turboglaucobiline a été réalisé à l’aide du grand spec-

r, 'graphe pour chimistes de Zciss.

Source : MNHN, Paris

H. T1X1EB

La position des maxima des bandes d’absorption a été précisée par

l’enregistrement microphotométrique. Ne connaissant pas la concentration

exacte en turboglaucobiline de la solution étudiée, nous avons établi la courbe

d’absorption en prenant arbitrairement la concentration ■■ Ar r.

Fig. i. — Courbes d’absorption de l’ester inéthylique de la biliverdino

dans l'ultra-violct et le visible.

La courbe d’absorption (fig. 3) présente deux maxima, l’un principal

situé à X 378 m^ , l’autre secondaire à X 307 m^ . Par son allure générale,

cette courbe est comparable celles des esters méthyliques de la biliverdine

Fig. 6. — Courbes d’absorption do l’ester méthylique de la glaucobiline (—)

et de la copro-glaucobiline (- - -) d’après A. Stern et F. Prückner.

(fig. 4), de la glaucobiline et de la coproglaucobiline (fig. 5). Cependant les

deux bandes d’absorption secondaires de la biliverdine, de la glaucobiline

Source : MNHN, Paris

PIGMENTS TÉTRAPYBROLIQUES

«L de la coproglaucobiline sont remplacées par une bande unique très nette.

En outre, la position du maximum principal (Max. I) de la turboglaucobiline

est intermédiaire entre celles des maxima de la biliverdine (X 384 mp ) d’une

part (88), de la glaucobiline (X 363 mp ) et de la coproglaucobiline (X 363 mp )

d’autre part (116).

Les positions des maxima de ces trois biochromes sont données dans le

tableau suivant :

Esters méthyliques

Max. I

Max. II

Max. III

Biliverdine IXa ....

384

316

282

Turboglaucobiline . . .

378

307

Glaucobiline IXa. . . .

363

315

286

Coproglaucobiline la . .

363

306

256

L’étude de la courbe d’absorption dans l’ultra-violet de la turboglauco-

bdine montre nettement que ce bilirubinoïde possède une structure analogue

à celle des pigments ayant une constitution fondamentale bila-lriène (bili-

v crdine, glaucobiline). Les deux ou trois atomes d’oxygène supplémentaires

lue possède ce pigment par rapport à la coproglaucobiline ne peuvent être

contenus que dans certains radicaux fixés aux noyaux pyrroliques. Le dé¬

placement du maximum principal d’absorption par rapport à ceux de la

glaucobiline et de la coproglaucobiline ne peut être imputé qu’à la présence

de ces radicaux oxygénés.

Spectres d’absorption dans le visible.

a) Solution neutre :

L’absorption dans le visible de la solution chloroformique neutre de la

turboglaucobiline a été étudiée à l’aide du spectrophotomètre de G. Yvon et

-L Jobin qui nous permet de déterminer la densité optique ô des solutions

laminées. Le coefficient d’extinction est calculé d'après la formule : e = -j^j-5,

c étant la concentration de la solution examinée, d l’épaisseur de la cuve.

Dans l’appareil, l’épaisseur de la cuve étant de 1 cm., la formule devient :

£ ~ ~5 et log. e — log. . Ne connaissant pas la concentration exacte en

turboglaucobiline de la solution étudiée, nous avons arbitrairement pris la

c °ncentration -P our établir la courbe.

La densité optique de la solution chloroformique bleue de la turboglau-

c °biline croit à partir d’un minimum situé vers X 490 mp , passe par un

Maximum vers X 655 mp, puis décroît lentement (fig. 3). Nous avons em-

P ,0 yé la même solution pour établir les courbes d’absorption dans le visible

l’ullra-violet, ce qui nous a permis de les réunir dans un même graphique.

Mémoires du Muséum, Zoologie, t. V. 6

74 R. TJXIER

Le maximum d’absorption de la turboglaucobiline dans le visible est

encore intermédiaire entre ceux de la biliverdine (X 665 ) et de la glau-

cobiline (X 640 m^ ).

b) Solution acide :

La densité optique de la solution chloroformique acide bleu-vert, obtenue

en ajoutant 2 gouttes d’alcool méthylique chlorhydrique à la solution pré¬

cédente, croît à partir d’un minimum qui se situe vers X 490 mj* et passe par

un maximum à X 665 m^ (fig. 6). La courbe d'absorption est entièrement

comparable à celle de la biliverdine dont le maximum se place à X 675 m^.

c) Sels complexes de zinc :

L’addition de quelques gouttes d’une solution alcoolique d’acétate de

zinc à 1 % à la solution chloroformique neutre de turboglaucobiline pro¬

fit». 7. — Courbes il 'absorption des sels do

zinc, oxydés par l'iode de la turboglauco¬

biline (—) et do la biliverdine (- - -).

voque le virage du bleu au vert par suite de la formation d’un sel complexe.

La densité optique de la solution croit régulièrement du violet au rouge,

sans qu’il soit possible de déceler au spcctrophotomètrc un maximum dans

le visible.

Par contre, après addition de quelques gouttes d’une solution alcoolique

d’iode 5 1 %, la liqueur devient rapidement bleue et présente alors une

intense fluorescence rouge et un spectre à deux bandes d’absorption carac¬

téristique : l’une principale 5 X 635 m^ l’autre, plus faible, 5 X 585 mp

(fig- 7).

La courbe d’absorption est comparable 5 celles des sels complexes de

zinc, oxydés par l’iode, de la biliverdine (fig. 7) et de la glaucobiline. Cepen-

Source : MNHN, Paris

PIGMENTS TÉTBAPYRBOLIQUES 75

dant les maxinia principaux se situent pour la biliverdine à A 640 m^ et pour

la glaucobiline à A 627 m^ (116).

Ainsi aussi bien dans le visible que dans l’ultra-violet les solutions detur-

boglaucobiline présentent des spectres d’absorption entièrement comparables

à ceux des bilirubinoïdes du groupe de la biliverdine ; elles ne diffèrent des

solutions de ces pigments que par les positions des maxima des bandes

d’absorption, les maxima de la turboglaucobiline étant intermédiaires entre

ooux de la biliverdine et de la glaucobiline.

c) CONCLUSION

Nous proposons de donner au pigment bleu isolé des coquilles de Turbo

Heyenfuasi le nom de turboglaucobiline.

Ce pigment, extrait sous forme d’ester inéthylique, puis purifié par chro¬

matographie, cristallise sous forme de prismes bleu-foncé (PF 205°-206°).

C’est le premier bilirubinoïde de Mollusques obtenu à l'état cristallisé. La

turboglaucobiline présente toutes les propriétés des pigment biliaires pos¬

sédant comme la biliverdine une structure bila-triène (couleurs et spectres

des solutions, test de Gmelin et réaction iodozincique) ; elle doit être consi¬

dérée comme un nouveau bilirubinoïde du groupe des verdines. Les spec¬

tres de ses solutions ont été soigneusement étudiés et comparés à ceux de

la biliverdine. Les maxima des courbes d'absorption dans l’ultra-violet et

l‘ ! visible ont des positions intermédiaires entre ceux de la glaucobiline et de

la coproglaucobiline, d’une part, et ceux de la biliverdine, d’autre part.

L’analyse élémentaire s’accorde avec les formules : CggH^OjgN^ C 39 II 46

9mN 4 et C 8B H 4# 0 18 N 4 . Ces formules, bien que voisines decelle de l’ester méthy-

Üqiie d’une coproglaucobiline C 89 H 46 O 10 N 4 , s'en distinguent cependant par

la présence de 12 ou 13 atomes d’oxygène au lieu de 10 pour une coproglauco¬

biline. Les deux atomes d’oxygène supplémentaires ne peuvent être con-

1 -anus que dans les chaînes latérales fixées sur les noyaux pyrroliques en

P°siLion (3. En effet, ainsi que nous l’avons signalé antérieurement, à une

s tructure déterminée correspond un ensemble de caractères donnés ; toute

substitution en position « entraînerait une modification de cette structure

et u n changement des propriétés générales du pigment. Dans le cas de la

turboglaucobiline, si les atomes d’oxygène supplémentaires étaient situés

en position a, les propriétés de ce pigment ne pourraient plus être compa-

ra bles à celles des bilirubinoïdes du groupe des verdines.

C’a près la teneur en groupements méthoxyle, la turboglaucobiline pos-

fi ède quatre fonctions acides comme une coproglaucobiline. Comme nous le

Ve rrons ultérieurement, l'analyse élémentaire de la turboglaucobiline donne

‘l'-s résultats comparables à ceux obtenus avec l'haliolivioline, pigment

Principal des coquilles d’il, cracherodii. Tous les pigments biliaires naturels

connus jusqu’à ce jour dérivaient de la protoporphyrine ; c’est la première

°' s que des bilirubinoïdes, ayant une composition voisine d'une coproglau-

Source : MNHN, Paris

t. TIXIER

cobilinc, sont signales dans le règne animal. Rappelons toutefois que la

porphobiline semble posséder des chaînes latérales analogues à celles de

l’uroporphyrine ; ce pigment a été obtenu par J. Waldenstrom (11) à

partir du porphobilinogène, dipyrrylméthane trouvé dans les urines de

malades atteints de porphyrie aiguë.

La présence, dans diverses coquilles de Mollusques, d’uroporphyrine I

pouvant par décarboxylation donner de la coproporphyrine I nous incite

à penser que la turboglaucobilinc possède une structure analogue à celles

de ces pigments et que les formules 0 12 N 4 et C 8# I l 4# 0 18 N 4 , qui font de

ce biochrome une dioxy- ou une trioxycoproglaucobiline, sont les plus vrai¬

semblables.

Chaque noyau pyrrolique des uroporphyrines possède un radical — CH 2 —

COOH et un groupement — CH 2 — CH 2 — COOII. Dans toutes les autres por-

phyrines et par conséquent dans tous les pigments biliaires pouvant en déri¬

ver, les radicaux élhanoïqucs de l'uroporphyrine sont remplacés par des

groupes méthyle — GH 8 . Aussi pensons-nous que la turboglaucobilinc possède

également quatre radicaux méthyle, fixés respectivement sur chacun des

quatre noyaux pyrroliques et que les atomes d’oxygène supplémentaires de

ce biochrome sont contenus dans les chaînes propanoïques, pour lesquelles

il est possible d'envisager les formules — CHOH — CH 2 —COOH ou— CH 2 —

CHOH—COOH, de tels radicaux pouvant conduire par décarboxylation

et déshydratation à des groupes vinylc : — Cil = CH g . Dans ce cas la for¬

mule développée de la turboglaucobilinc renfermerait soit deux, soit trois

radicaux oxypropanoïques et correspondrait au schéma suivant :

«3 C |

) - CH--

R) = CHOH — CH, — COOH ou — CH, — CHOH — COOH.

Alors que les coproporphyrincs renferment quatre chaînes laLérales pro¬

panoïques, les proLoporphyrines n’ont plus que deux restes propanoïques,

les deux autres étant remplacés par des groupes vinyle — CH = Cll 2 . D’après

les travaux de M. Grinstein et de ses collaborateurs (8), la coproporphyrine

III serait directement synLhétisée par l’organisme et se trouverait à l’ori¬

gine de la protoporphyrine IX, deux des groupements propanoïques étant

transformés en radicaux vinyle par décarboxylation et déshydrogénation.

Ces données confirment la théorie de W. J. Turner (10) selon laquelle les

groupe vinyle se forment aux dépens des chaînes propanoïques. Or on a

observé que la décarboxylation biologique n’était possible que dans les sys¬

tèmes— CO — COOII,— CO — CHg — COOH et — CH (Nil,) — COOH. Si

la formule proposée pour la lurboglaucobiline était confirmée, il faudrait consi-

Source : MNHN, Paris

PIGMENTS TÉTRAPYKR0LIQUE8

‘forer les chaînes latérales oxypropanoïques de ce pigment, soit comme des

formes de passage entre les radicaux propanoïques et vinyliques, soit comme

des précurseurs de ces deux groupements.

Nous ne pouvons momentanément proposer cette formule développée

‘l u c comme une hypothèse de travail, n’ayant eu à notre disposition qu’une

frop faible quantité de pigment pour pouvoir en étudier les produits de

dégradation.

Ainsi, bien que l’étude de la turboglaucobiline ne permette pas d’émettre

une formule définitive pour ce nouveau bilirubinoïde, elle donne toutefois

un premier aperçu sur la constitution chimique des pigments biliaires des

coquilles de Mollusques.

B. — Pigments biliaires des coquilles de Turbo marmoralus L.

a) PRÉPARATION

1° Extraction et estérification des pigments.

Une coquille (450 g. environ) de Turbo marmoralus est attaquée par de

l’alcool méthylique chlorhydrique à 12 %. La liqueur alcoolique se colore

ra pidemcnt en bleu-vert. Aprèâ 24 heures les pigments sont extraits par

du chloroforme selon la technique décrite antérieurement. La couche

chloroformique décantée, puis lavée avec une solution de carbonate de

sodium à 5 pour 100, est finalement desséchée avec du sulfate de sodium

anhydre.

2° Purification et séparation des pigments par chromatographie.

Après filtration, la solution chloroformique est évaporée à sec et le résidu

cepris par un mélange & volumes égaux de chloroforme et d’éther. La solu¬

tion éthéro-chloroformique est alors filtrée sur une

colonne d’alumine, préalablement désactivée par

lavages à l’alcool méthylique. Le chromatogramme

est ensuite développé à l’aide de chloroforme pur.

Une première zone bleu clair descend le long de la

colonne d’alumine, suivie d’une zone principale bleu

foncé (fig. 8).

En haut de la colonne demeure une zone brun

rou ge. Lorsque les zones bleues atteignent respecti¬

vement le bas de la colonne, nous recueillons séparé¬

ment les solutions bleues qui filtrent.

Le chromatogramme ainsi obtenu est identique à

celui observé dans les mômes conditions avec la solution pigmentaire de

*• Iteyenfussi. Dans les deux cas nous constatons la formation de deux

z.II

bleu foncé

z. 1

bleu pâle

Source : MNHN, Paris

78 R. TIXIER

zones bleues : l’une inférieure (zone I), ne correspondant qu’à des traces

de pigment, l’autre supérieure (zone II), plus importante.

Par évaporation spontanée de la solution chloroformique correspondant

à la zone I, nous n’obtenons qu’un produit impur, mal cristallisé, constitué

par quelques aiguilles bleues.

Par évaporation de la solution chloroformique correspondant à la zone II,

le pigment cristallise sous forme de prismes bleu foncé, réunis en houppes.

Ce pigment est rechromatographié sur alumine et rccristallisé dans un mélange

de chloroforme et d’acétate d’éthyle.

Nous obtenons ainsi quelques milligrammes de pigment cristallisé.

b) PROPRIÉTÉS

Le pigment, isolé des coquilles de T. marmoralus à l’état cristallisé, est

identique à la Lurboglaucobiline. Sa forme cristalline et ses solubilités sont

comparables, son point de fusion pris au bloc de Maquenneestde205°-206°.

Le mélange des deux pigments ne montre aucun abaissement du point de

fusion. L’identité des deux pigments a été en outre établie par une chroma¬

tographie mixte. Une solution chloroformique des deux pigments est addi¬

tionnée d’un égal volume d’éther, puis fdtrée sur une colonne d’alumine.

Le chromatogramme étant développé avec du chloroforme pur, une seule

zone se forme et descend le long de la colonne.

Les spectres d’absorption du pigment, isolé des coquilles de T. marmo¬

ralus, sont également semblables à ceux de la turboglaucobiline. Le spectre

d’absorption dans I’ultra-violet de la solution chloroformique présente deux

maxima dont les positions sont identiques à celles des maxima de la turbo¬

glaucobiline ; le maxima principal se situe à X 378 m^ , le maximum secon¬

daire à X 307 rn|x . La courbe d’absorption dans le visible de la solution chloro¬

formique neutre est également superposable à celle de la turboglaucobiline.

La densité optique croît d’un minimum vers X 400 ni|i pour passer par un

maximum à X 655 m» . Le spectro d’absorption du sel complexe de zinc,

oxydé par l’iode, est aussi comparable à celui de la turboglaucobiline. La

solution chloroformique, après addition d’acétate de zinc et d’iode, présente

une coloration bleue, une intense fluorescence rouge et deux bandes d’absorp¬

tion, dont le maximum principal se situe à X 635 m^ , le maximum secon¬

daire à X 585 m,* .

c) CONCLUSION

Les pigments bleus des coquilles de Turbo marmoralus sont comparables

à ceux des coquilles de T. Heijenfussi. Le pigment bleu principal, obtenu

à l’état cristallisé, présente des propriétés identiques à celles do la turbo¬

glaucobiline.

Source : MNHN, Paris

PIGMENTS TÉTBAPYHROLIQÜES

C. — Pigments biliaires des coquilles de Turbo elegans Phil.

a) PRÉPARATION

1° Extraction et estérification des pigments.

2 coquilles (200 gr. environ) sont immergées dans de l’alcool méthylique

a 12 %. Après 24 heures les pigments sont extraits par du chloroforme selon

la technique décrite antérieurement. La couche chloroformique, après décan¬

tation et lavages avec une solution de carbonate de sodium à 5 %, est finale¬

ment déshydratée avec du sulfate de sodium anhydre.

2° Séparation des pigments par chromatographie.

La solution chloroformique, après filtration, est concentrée à 5 cm* et

additionnée d’un égal volume d’éther. La solution éthéro-chloroformique

est versée sur une colonne d’alumine préalablement désactivée par lavages

avec l'alcool méthylique. Le chromatogrammc, développé avec du chloro¬

forme pur, est identique h celui obtenu avec une solution pigmentaire des

coquilles de T. Regen/ussi.

Une zone principale bleue se détache et descend le long de la colonne

d’alumine, précédée d’une zone bleu pâle.

Par évaporation spontanée de la solution chloroformique, correspondant

à la zone principale, le pigment cristallise sous forme de prismes bleu foncé,

réunis en houppes.

b) PROPRIÉTÉS

La quantité de pigment obtenu à l’état cristallisé étant très faible, nous

n’avons pu elTectuer qu’une chromatographie mixte et examiner les spectres

d’absorption dans le visible.

Une solution chloroformique du pigment cristallisé et de la turboglauco¬

biline est additionnée d’un égal volume d’éther, puis filtrée sur une colonne

d’alumine désactivée. Le chromatogramme est développé à l’aide de chloro¬

forme pur. Une seule zone se forme et descend lentement le long de la

colonne d’alumine. Aucune séparation des deux pigments n’étant observée,

nous pouvons penser qu’ils sont identiques.

La courbe d’absorption de la solution chloroformique neutre du pigment

cristallisé est superposable à celle de la turboglaucobiline. Le maximum

d’absorption se situe à X 655 m^.

Le spectre d'absorption du sel complexe de zinc, oxydé par l’iode, est

également comparable à celui de la turboglaucobiline, obtenu dans les mêmes

conditions. Le maximum principal se situant à X 635 ny, le maximum

secondaire à X 585 m^.

Source : MNHN, Paris

B. T1XIER

o) CONCLUSION

Le chromatogrammc, obtenu avec la solution pigmentaire «les coquilles

de Turbo elegans, est comparable à celui observé dans les mêmes conditions

avec les biochromes des coquilles de T. Regenjussi. Le pigment principal,

cristallisé, a été identifié avec la turboglaucobilinc par une chromatographie

mixte ; les spectres d'absorption dans le visible de ces deux pigments sont

II. — PIGMENTS BILIAIRES DES HALIOTIDÉS

Les Haliotidés sont des Mollusques Gastéropodes Prosobranches. Leurs

coquilles sont ovales, avec une spire courte, excentrique ; elles sont pourvues

d’une rangée de perforations permanentes. Ces coquilles sont recherchées

pour leur nacre.

Nous avons examiné les pigments des coquilles bleues d'IIaliolis crache-

rodii Leach, originaires des côtes de Californie. Le matériel, étudié antérieure¬

ment par les divers auteurs sous le nom A'II. californiensis Sow., est selon

toute vraisemblance identique à H. cracherodii Leach, dont II. californien-

sis n'est qu’une variété peu commune.

a) PRÉPARATION

1° Extraction et estérification des pigments.

Les diverses extractions des pigments d'IIaliolis effectuées au cours de

ce travail ont été conduites selon la technique suivante : 5 coquilles d ’tlalio-

tis cracherodii (300 gr. environ) sont immergées pendant 12 heures dans

4 litres d’alcool méthylique chlorhydrique à environ 12 %. Les pigments

sont ainsi dissous et estérifiés. Après concentration sous vide à environ

1.500 cm 3 , la solution alcoolique bleu-vert est additionnée de 500 cm* de

chloroforme, puis le mélange obtenu est dilué avec de l’eau distillée jusqu'à

apparition d’un trouble blanchâtre. Une partie du chloroforme se sépare

en une couche verte, tandis que la liqueur surnageante reste colorée en bleu.

Au cours de la neutralisation progressive de cette dernière à l’aide de bicar¬

bonate de sodium, des gouttelettes de chloroforme se séparent et se rassem¬

blent en une nouvelle couche violette. Finalement tous les pigments passent

en solution chloroformique et la fraction aqueuse ne présente plus qu’une

teinte vert pâle.

Après un premier lavage à l’eau distillée, la solution chloroformique est

agitée à deux reprises avec une solution de carbonate de sodium à 5 %, puis

de nouveau avec de l’eau distillée.

2° Séparation des pigments par chromatographie.

Après distillation du chloroforme sous vide, le résidu pigmentaire est

repris par 50 cm* de chloroforme neutre et sec. La solution violette obtenue

Source : MNHN, Paris

PIGMENTS TÉTBAPYBBOLIQÜES

est filtrée sur une colonne d’alumine désactivée (90 g.) qui retient les pig-

nients dans sa portion supérieure. La colonne est alors lavée au chloroforme

pour éliminer les substances étrangères, qui ne sont pas retenues par l’alu-

mine, puis le chromatogramme est développé à l’aide de chloroforme conte¬

nant 0,5 % d’alcool inéthylique (fig. 9a).

En premier lieu, une zone verte (zone. I) se détache de la portion colorée

supérieure et descend progressivement le long de la colonne d’alumine, suivie

d’un anneau violet rouge (zone 11). Lorsque ces deux zones colorées atlei-

;.IV violette

: .III brun rouge

z.II violette

I verte

fïnent l’une après l’autre le bas de la colonne, les solutions correspondantes,

v crte puis violette, sont recueillies au moment de leur filtration. Durant

Ce premier développement, un anneau brun rouge (zone III) se forme juste

a u-dcssous de la zone violet foncé supérieure (zone IV).

L’emploi de chloroforme additionné de 1 % d’alcool méthylique permet

Un nouveau développement du chromatogramme (fig. 9 b). La zone brun

r °uge (zone III) chemine le long de la colonne d’alumine, tandis qu’une

zone violette (zone IV) correspond au pigment principal, se détache à son

tour de la portion supérieure qui reste colorée en bleu (zone V). Les solutions

brun-rouge puis violette sont recueillies lorsque les zones correspondantes

éteignent respectivement le bas de la colonne d’alumine.

3° Purification des pigments.

Piymenl de la zone I.

Lavée ii l’eau distillée, puis concentrée it quelques cm*, la solution chloro-

oimique verte est à nouveau filtrée sur une colonne d’alumine. Du chloro-

® r me, contenant 0,1 puis 0,2 % d’alcool méthylique, est versé sur la colonne.

e n’est que lorsque la proportion d’alcool méthylique atteint 0,5 % qu’une

zone verte homogène descend lentement le long de la colonne, tandis qu’une

b'nicc couche violette demeure dans la portion supérieure. La solution

«•’ recueillie lorsque la zone colorée atteint le bas de la colonne, est

broinatographiquement pure. La quantité de pigment étant trop minime

Source : MNHN, Paris

B. TIXXEB

pour pouvoir tenter son isolement, nous n’étudierons que les propriétés de

ses solutions, en particulier leurs spectres d’absorption.

Pigment de la zone II.

Ce pigment est également purifié par une nouvelle chromatographie de

sa solution chloroformique concentrée. Après fixation du pigment, la colonne

d’alumine est lavée avec du chloroforme, contenant des proportions crois¬

santes d'alcool méthylique. Lorsque la proportion atteint 1 %, une zone

violette nettement délimitée se forme et chemine jusqu’au bas de la colonne

d’alumine. Par suite de la faible teneur en pigment violet rouge de la solu¬

tion ainsi puriliée, nous avons dû nous contenter d’une étude qualitative.

Pigment de ta zone III.

Lavée à l’eau distillée puis concentrée, la solution chloroformique brun

rouge est de nouveau passée sur une colonne d’alumine. Après adsorption

du pigment brun rouge, la colonne est lavée avec du chloroforme contenant

1 puis 2 % d’alcool méthylique, qui entraîne des traces de pigment violet.

Le chromatogramme est finalement développé avec du chloroforme ren¬

fermant 3 % d’alcool méthylique. Une zone rouge orange se sépare et descend

le long de la colonne précédée et suivie d’anneaux jaunes, tandis qu’un

pigment violet demeure à la partie supérieure. Le filtrat jaune d’or, corres¬

pondant h la zone rouge orange, est recueilli lorsque cette dernière atteint

le bas de la colonne.

Afin d’obtenir une solution pure du biochrome principal rouge orange,

le filtrat recueilli est soumis h une dernière analyse chromatographiquc qui

permet d’éliminer toute trace de pigments étrangers.

Ce biochrome est finalement précipité par addition d’éther de pétrole

fi sa solution chloroformique concentrée. Dans ces conditions nous avons

obtenu environ 1 mg. de précipité amorphe sec. Les quelques essais de

cristallisation effectués sont demeurés sans résultat.

Pigment de ta zone IV.

Déshydratée à l’aide de sulfate de sodium sec, puis concentrée à environ

5 cm*, la solution chloroformique violette est additionnée de deux fois son

volume d’éther anhydre. Le pigment principal est alors précipité par passage

de gaz chlorhydrique sec au sein du mélange de solvants. Séparé sous forme

de flocons bleus amorphes, le chlorhydrate du pigment est recueilli, lavé

à l’éther, puis dissous dans du chloroforme.

Après lavages à l’aide d’une solution de carbonate de sodium à 5 %, la

solution chloroformique eBt de nouveau chromatographiée sur alumine

désactivée. Le pigmenL violet se sépare en une zone nette, qui descend le

long de la colonne d'alumine lorsque la proportion d’alcool méthylique,

ajoutée au chloroforme, est de 3 %. Lorsque cette zone arrive au bas de la

Source : MNHN, Paris

PIGMENTS TÉTRAPYRROI.IQUKS

colonne, le filtrat violet correspondant est recueilli. En haut de la colonne

demeure une nouvelle zone résiduelle bleue.

Réduite à quelques cm 8 , la solution chloroformique violette est additionnée

d éther de pétrole, puis mise à la glacière. Le précipité formé est recueilli,

essoré et séché. Nous avons ainsi obtenu environ 14 mg. de pigment amorphe.

Une préparation antérieure, conduite d’une façon un peu différente, nous

avait donné une quantité équivalente de pigment.

b) PROPRIÉTÉS DES PIGMENTS

1° Pigment de la zone I.

Les solutions chloroformique ou alcoolique du pigment vert présentent

des réactions et des spectres d’absorption qui montrent nettement la parenté

du biochrome avec les bilirubinoïdes du groupe des verdines (voir pages 63

64), c’est-à-dire des pigments biliaires possédant trois doubles liaisons

(bila-triènes). Cependant, bien que possédant les propriétés générales des

verdines, ce pigment se distingue par diverses particularités, qui indiquent

Une différence de détail dans sa constitution chimique.

Ses solutions neutres sont plus vertes que celles des esters méthyliques

de la biliverdine ou de la turboglaucobiline, qui tendent vers le bleu. Avec

1 acide nitrique nitreux, elles virent au bleu, puis au violet, au rouge et à

1 orange, donnant ainsi les diverses phases du test de Gmelin, à l’exception

de la phase jaune finale de cette réaction. Additionnées d’acétate de zinc

et d’iode (réaction iodo-zincique), les solutions passent rapidement du vert

Jaune au bleu ; on même temps apparaît le spectre d’absorption caractéris-

l '«iue à deux bandes des sels do zinc des bilipurpurines, mais aucune fluores¬

cence rouge ne peut être décelée. Cette absence de fluorescence des complexes

linéiques se retrouve dans toute la série des pigments d 'H. cracherodii ;

c est l'une des propriétés qui distingue ces bilirubinoïdes des biochromes

de la série bilirubinique. Des constatations similaires ont été faites par H. Fis¬

cher (124) pour quelques dérivés synthétiques des esters méthyliques de la

bilirubine et de la biliverdine, dont nous parlerons ultérieurement.

Spectres d’absorption.

a) Solutions neutres :

i'’allure de la courbe d’absorption du pigment vert dans le chloroforme

081 entièrement comparable à celle des courbes observées avec les esters

méthyliques de la biliverdine IX«, de la mésobiliverdine IXa (ou glauco-

biline) et de la turboglaucobiline. C’est ainsi que dans l’ultra-violet cette

c °urbe présenLe un maximum principal à X 402 mg et deux maxima secon¬

daires à X 322 mg et ù X 27. r > mg (fig. 10). Le maximum principal est

déplacé vers les grandes longueurs d’ondes par rapport à celui de l’ester

méthylique de la biliverdine, qui se situe à X 384 mg (fig. 4). Un tableau

Source : MNHN, Paris

84 B. TIXIKR

donnant les positions des maxinia de la biliverdine, de la mésobilivcrdine

(glaucobiline) et de la coproglaucobiline est donné au cours de l’étude des

propriétés de la lurboglaucobilinc (voir page 73).

Dans le visible, la courbe d’absorption du pigment vert est également

comparable à celle de la biliverdine, mais le maximum se situe à X 702 m^ au

lieu de X 665 m^ pour la biliverdine (fig. 10). C’est la première fois qu’il nous

est donné de constater un décalage aussi sensible des maxima d’absorption

vers les grandes longueurs d’ondes chez un pigment du groupe des verdines.

11 est à noter également que les maxima des solutions chloroformique ou

alcoolique du pigment vert dans le visible sont identiques ; or, comme

nous le verrons ultérieurement, la polarité du solvant exerce une influence

marquée sur les positions des maxima du pigment brun rouge de la zone III.

b) Solutions acides :

Après addition de quelques gouttes d’alcool méthylique chlorhydrique,

la solution chloroformique vert vif présente une courbe d’absorption dont

le maximum se situe à X 655 m^ (fig. 10) ; or, dans le cas des verdines un

décalage inverse se produit, le maximum étant à X 675 m^ pour la bili¬

verdine acide.

c) Sels complexes de zinc :

Lorsque quelques gouttes d’une liqueur alcoolique d’acétate de zinc à

1 0/0 sont versées dans la solution chloroformique neutre, la teinte de

celle-ci vire au jaune vert et le maximum d'absorption passe à X 755 m^.

Si nous ajoutons ensuite une ou deux gouttes d’une solution alcoolique

d’iode à 1 0/0, la teinte passe progressivement au vert puis au bleu ; en

Source : MNHN, Paris

PIGMENTS TÉTRAPYBROLIQÜES 83

même temps apparaît le spectre caractéristique à deux bandes des sels

de zinc des bilipurpurincs, le maximum principal étant à X 665 m^ et le

maximum secondaire à X 615 m^ (fig. 11). Dans des conditions identiques,

l’ester méthylique de la biliverdine présente

un maximum principal à X 640 m^ et un

maximum secondaire à X 590 m^ .

Dans le cas de la biliverdine apparaît égale¬

ment une intense fluorescence rouge ; avec le

pigment vert d’Haliolis cracherodii aucune fluo¬

rescence n’est visible.

Ainsi le pigment vert d ’H. cracherodii pré¬

sente de nombreuses analogies avec les verdines,

mais des différences notables dans les positions

des maxima d’absorption et l’absence de fluo¬

rescence du complexe zincique oxydé montrent

flue ce biochrome possède une constitution

quelque peu différente des autres bilirubinoïdes

^ structure bila-triène (voir page 64).

Signalons qu’au cours d'une étude succincte

des pigments d’Haliolis rufescens, nous avons

s ^paré par chromatographie sur alumine un

Pigment vert, dû à une oxydation partielle du biochrome rouge des coquil-

i°s en milieu alcoolique acide. Les solutions de ce pigment donnent, avec

l’acide nitrique nitreux, les phases bleue, violette, rouge et orange du test

0,7

0,5

0,3

0,1

Fia. 12. — Courbe d’absorption d’un pigment vert d’Haliotis rufescens.

Fia. 11. — Courbe d'absorption

du pigment vert après addit ion

«l'acètate de zinc et d’iode.

e Gmelin. Additionnées d’acétate de zinc et d’iode, elles passent au bleu¬

et puis au bleu, mais ne montrent aucune fluorescence rouge (réaction

*°dozincique). La courbe d’absorption en milieu chloroformique présente

Source : MNHN, Paris

H. TIXIEK

dans l’ultra-violet un maximum principal à X 395 m^ et deux maxima

secondaires à X 315 m^ et à X 272 uy ; le maximum dans le visible se situe

à X 685 m,, (fig. 12).

Les propriétés de ce pigment sont donc comparables à celles du biochrome

vert d'H. cracherodii ; cependant ces deux bilirubinoïdes ne sont pas iden¬

tiques, car leur comportement chromatographique est différent, le pigment

vert d’H. rufescens ne pouvant être détaché de la partie supérieure de la

colonne d’alumine qu’à l’aide de chloroforme contenant 5 % d’alcool méthy-

lique. dette étude préliminaire, dont nous reparlerons au cours de l’étude

du pigment jaune orange de la zone III, devait être signalée, car elle indique

une parenté probable entre les pigments d’H. rufescens et d’H. cracherodii.

Réduction.

Afin de savoir si le pigment vert de la zone 1 devait être considéré comme

un produit d’oxydation du biochrome jaune orange de la zone III, nous

l’avons réduit à l’aide d’hydrosulfite de sodium pour passer du stade verdine

à celui de rubine (voir page 64).

Agitée avec de l’hydrosulfite de sodium en poudre et quelques cm* d’eau

distillée, la solution chloroformique acide, vert vif, devient rapidement

vert, jaune, puis jaune orange. Lavée à l’eau distillée puis avec du carbonate

de sodium à 5 %, la solution chloroformique jaune orange est examinée au

spectrophotomètre de Beckman, puis versée sur une colonne d'alumine.

Les pigments éLant absorbés à la partie supérieure de la colonne, celte der¬

nière est lavée avec du chloroforme, contenant des proportions croissantes

d’alcool méthylique. Quand la proportion d’alcool est de 1 %, une zone verte,

correspondant au pigment non réduit, se détache puis s’élimine à travers

la colonne ; lorsque la quantité d’alcool atteint 3 %, le pigment encore fixé

à la partie supérieure se rassemble en une zone orange unique qui chemine

peu à peu jusqu’au bas de la colonne ; le filtrat jaune d’or correspondant

à cette zone est alors recueilli.

Pour essayer d’établir l’identité de ce pigment jaune orange avec celui

de la zone III, nous avons tout d’abord examiné les spectres d’absorption

des solutions chloroformique et alcoolique, puis procédé à une chromato¬

graphie mixte de ces deux biochromes.

Une particularité intéressante du pigment de la zone III réside dans les

modifications notables que subissent les spectres d’absorption quand la

polarité du solvant varie. C’est ainsi que le maximum d’absorption qui se

situe à X 440 m p en milieu chloroformique passe à X 495 mj* quand le solvant

utilisé est de l’alcool absolu.

Un décalage analogue des maxima d’absorption se produit avec le pigment

jaune orange provenant de la réduction de biochrome vert quand le solvant

varie. L'examen spectroscopique des solutions chloroformique et alcoolique

avant chromatographie donne des courbes d'absorption dont les maxima

sont identiques à ceux du pigment III (X 440 iiip dans le chloroforme et

Source : MNHN, Paris

PIGMENTS TÉTRAPYRROLIQUES

A 495 men milieu alcoolique). Par contre, la solution chloroformique

jaune d’or du pigment chromatographié présente un maximum dont la

position est quelque peu différente du biochrome de la zone III (X 452 m^

au lieu de X 440 m^ ) ; cependant en milieu alcoolique le maximum se situe

toujours à X 495 mj*.

Après avoir filtré le mélange des solutions chloroformiques jaunes des

deux pigments sur une colonne d'alumine (qui fixe les biochromes dans sa

partie supérieure), du chloroforme, contenant des proportions croissantes

4’alcool méthylique, est peu à peu verse sur la colonne. Lorsque la propor¬

tion d’alcool atteint 3 %, une zone unique se forme et descend le long de la

colonne ; cependant la teinte de cette zone, orange dans le haut, plus rouge

vers le bas, n’étant pas uniforme, aucune conclusion ne peut être réellement

déduite de cet essai.

Ainsi, bien que l’identité de ces deux pigments jaune orange soit probable,

les essais effectués n’ont pu l’établir avec certitude.

2° Pigment de la zone II.

Les propriétés du pigment violet de la zone II sont comparables à celles

du biochrome de la zone IV, auquel nous avons donné le nom d’halioti-

v >oline. II s’agit vraisemblablement de deux pigments isomères, que seule

* analyse rhromatographique permet de différencier. Cependant, alors que

le biochrome de la zone IV constitue le pig¬

ment principal des coquilles d ’Haliolis, celui

de la zone II n’existe qu’en très faible quan¬

tité. Les essais de chromatographie mixte sur

Rumine montrent qu’il s’agit de deux pig¬

ments différents, bien que leurs réactions et

leurs spectres d’absorption soient identiques.

Les solutions neutres rouge violet devien¬

nent bleu indigo après addition d’acétate de

Z| nc, et bleues ou bleu vert par acidification.

Avec l’acide nitrique nitreux, elles passent du

Ideu au violet et au rouge, sans donner les

a utres phases de la réaction de Gmelin. Cepen-

datil, agitée avec de l’hydrosulfite de sodium

“** de l’eau distillée, la solution chloroformi¬

que, devenue jaune orange, donne avec l’acide

mtrique nitreux les phases bleue, violette,

rouge et orange du test de Gmelin.

Les courbes d’absorption dans le visible des

8 °lutions chloroformiques neutre et acide ont

d<-‘B maxima situés respectivement à X 560 m» et à X 625 mp

c °mplexe zincique ayant un maximum à X 600 ny (fig. 13).

A//

\ \

/ /A

/ ;/

/ 11

*> ’i

'i \

i ‘ '

/ i!

1 >

\ '

Fio. 13. — Courbes d’absorption

du pigment violet, (—) en solu¬

tion neutre, (-. -. -) en solution

acide, (- - -) sel complexe de

zinc.

Source : MNHN, Paris

B. T1XIEB

Ces courbes sont superposables à celles de l’haliolivioline. Par les cou¬

leurs de ses solutions, le pigment de la zone II s’apparente aux bilirubinoïdes

qui, comme la mésobilivioline, ont une structure bila-diène (a, b) (voir

page 64). Cependant, de même que l’haliotivioline, il se différencie des autres

violincs par l’absence de fluorescence de son complexe zincique. Par réduc¬

tion de ce pigment à l’aide de poudre de zinc en milieu acétique, il est toute¬

fois possible d’obtenir des produits fluorescents ; la solution acétique bleue,

devenue brun rouge puis jaune pâle, redevient, après séparation de la poudre

de zinc et agitation à l’air, brun rouge puis violette ; elle présente alors une

intense fluorescence rouge.

Les réactions indiquées pour le pigment violet de la zone II sont ana¬

lysées en détail dans l’étude de l’haliotivioline.

3° Pigment de la zone III.

Les solutions chloroformiques du pigment de la zone III sont rouge orange

ou jaune d’or suivant leur concentration en biochrome ; les solutions alcoo¬

liques sont brun rouge terne. Ce changement de la teinte des solutions, sui¬

vant la polarité du solvant, s’accompagne de modifications spectroscopiques.

Avec l’acide nitrique nitreux les solutions de ce pigment passent du jaune

au vert, puis au bleu, au violet, au rouge et à l’orange. Ces diverses phases

colorées sont identiques à celles données dans les mêmes conditions par les

pigments biliaires du groupe des ru bines (bilirubine par exemple) ; cepen¬

dant la phase jaune finale du test de Gmelin fait défaut.

Additionnée d’acétate de zinc et d’iode, la solution chloroformique jaune

d’or vire progressivement au vert, puis au bleu (réaction iodozincique).

Cette dernière solution présente la couleur et le spectre caractéristique à

deux bandes d’absorption des purpurines, mais ne montre pas la fluores¬

cence rouge des complexes zinciques de ces bilirubinoïdes. Celte absence de

fluorescence, déjà signalée lors de l’étude du pigment vert de la zone I,

est particulière à la série des biochromes des coquilles d’H. cracherodii.

Elle a également été signalée par H. Fischer pour divers dérivés synthé¬

tiques de la bilirubine ; c’est ainsi que les esters méthyliques des bilirubines

1 k C (=jC H!! CH2 ci| ifc.- CHj CH=CH2

*%/=«- ^ j -Clfe-^ JJ- CH = (^JoCB3

dont les groupements — OH en position 1’ ou 8’ sont remplacés par des métho-

xyle — OCH a (124), ainsi que ceux des bilirubines dont le carbone en b est

lié à un noyau benzénique ( —CH— au lieu de — CH a —) donnent

<VI 8

avec l’acétate de zinc et l’iode des solutions non fluorescentes.

Source : MNHN, Paris

PIGMENTS TÉTRAPYRROLIQÜES

Les solutions acides du pigment jaune orange de la zone III deviennent

ra pidement vertes par oxydation à l’air ; par contre, les solutions neutres

sont relativement stables à l’obscurité.

Spectres d’absorption.

Les solutions de ce pigment présentent des particularités spectroscopiques

caractéristiques. En effet, suivant la polarité du solvant, les couleurs des

solutions sont sensiblement différentes et les spectres présentent un déplace¬

ment important des bandes d’absorption. Des modifications comparables

de couleurs et de spectres ont déjà été signalées chez les caroténoïdes possé¬

dant une fonction cétonique en conjugaison avec une chaîne ayant plusieurs

doubles liaisons (rhodoxanlhine) (125). De telles modifications de spectres

n avaient pas encore été signalées dans la série des pigments biliaires ; elles

ne s °nt d'ailleurs sensibles qu’avec le pigment orange de la zone III, ce qui

Se inble indiquer que la présence d’un carbone saturé au pont b est néces-

® a,re - Ces modifications sont dues, selon toute vraisemblance, à la présence

dans les chaînes latérales de groupements cétoniqucs pouvant s’énoliser.

ous reviendrons ultérieurement sur cette question, au cours de l’inter-

PÇétalion générale de nos observations sur les propriétés des pigments

d cracherodii.

D - — Courbe d’absorption «lu pigment jaune orauge dans un mélange do chloroforme

et d'alcool inéthylique.

-Mémoiiibs du Muséum, Zoologie, t. V. 7

Source : MNHN, Paris

B. TIXIKR

a) Solutions neutres :

La solution jaune d’or recueillie lors de la chromatographie du pigment

présente dans l’ultra-violet une bande d’absorption à X 285 ny et dans le

visible deux bandes d’égale intensité, dont les maxima se situent à X 442 ny

et à X 480 ny (fig. 14). La présence de deux bandes d’absorpLion dans le

visible est due au fait que le solvant est un mélange de chloroforme et d’alcool

méthylique. En effet, la solution jaune d’or, obtenue en dissolvant 250 y

de pigment dans 10 cm* de chloroforme, possède une courbe d’absorption

ne présentant plus que deux maxima, l’un à X 270 ny , l’autre à X 440 ny

(e sp = 26), cependant une inflexion subsiste à X 475 ny. De même la

solution alcoolique brun rouge, de concentration identique, montre deux

Fig. 15. — Courbe d’absorption du pigment jaune orange (—) dans le chloroforme, (- - •)

dans l'alcool absolu.

maxima l’un à X 300 ny et l’autre à X495 ny (e sp = 26), ainsi qu’un acci¬

dent à X 445 ny ( fig. 15).

Ainsi, suivant le solvant employé, les positions des maxima varient ; il

sullit d’ailleurs de diluer la solution chloroformique avec de l’alcool absolu

pour provoquer un affaiblissement de la bande à X 440 ny et le développe¬

ment de la bande à X 495 ny ; l'addition de chloroforme è la solution alcoo¬

lique provoque le phénomène inverse. Il semble exister un état d’équilibre

entre deux structures chimiques différentes, probablement entre une fonc¬

tion cétoniquc et sa forme énolique.

L’énolisation d'une fonction célonique en présence d’un solvant polaire

entraîne la formation d’une double liaison entre deux atomes de carbone.

Or, la présence de doubles liaisons dans les chaînes latérales des pigments

biliaires provoque un décalage des bandes d’absorption vers les grandes

longueurs d'ondes ; le déplacement vers le rouge des maxima d’absorption

du pigment jaune orange en milieu alcoolique s'expliquerait ainsi par l'appa-

Source : MNHN, Paris

PIGMENTS TÉTRAPYRROLIQUES

rition de doubles liaisons, due à l'énolisation d’une ou de plusieurs fonctions

cétoniques, contenues dans des chaînes latérales. Notons que le maximum

de la solution chloroformique du pigment de la zone III se situe dans la

même région du spectre que celui de la bilirubine (maximum vers X 450 m^).

b) Solutions acides :

Additionnée de deux gouttes d’alcool inéthylique chlorhydrique, la solu¬

tion chloroformique jaune d’or passe au jaune vert, mais ne présente pas

de modification spectroscopique sensible. La courbe d’absorption dans le

visible possède un maximum à X 440 m,* et une inflexion à X 480 m^ ; en

Fig. 18. — Courbes d'absorption du pigment jaune orange en milieu acide

(—) dans le chloroforme, (- - -) dans l’alcool absolu.

ou trc apparaît une nouvelle bande à X 612 m^ due à la présence du pigment

Ver t (fig. 16).

La solution alcoolique acidifiée présente un verdissement plus intense,

"lais son spectre d’absorption reste comparable à celui de la liqueur neutre,

* e maximum principal se situant à X 495 m^. La présence d'une bande

d’absorption à X 630 m^ est due à l’oxydation partielle du pigment en vcr-

dine (fig. 16) (voir page 64).

c) Sels de zinc :

Après addition de quelques gouttes d’une liqueur alcoolique d’acétate de

zinc à 1 %, la solution jaune d’or, provenant directement de la chroma¬

tographie, passe au rouge cerise. Elle présente trois bandes d’absorption

d"nt les maxima se sit lient respectivement à X 460 m^, X 495 m^ et X 535 m^

17). Le solvant employé au cours de la chromatographie étant, un mé-

a "gc de chloroforme et d’alcool, le spectre obtenu correspond fi une super¬

position des bandes d’absorption observées soit avec le chloroforme pur, soit

Source : MNHN, Paris

R. TAXI EU

avec l’alcool absolu. En eiTet,le spectre du complexe zincique en solution

chloroformique est caractérisé par deux bandes, l’une principale à X 460 m«

Rio. 17. — Courbe d’absorption du pigment jaune orange dans un mélange de chloroforme

et d’alcool méthylique après addition d’acétate de zinc.

l’autre secondaire à X 532 m^. Par contre, en milieu alcoolique, le maximum

principal se situe à X 490 m^ et le maximum secondaire à X 535 m^, (fig. 18).

Ainsi l’influence du solvant sur les spectres du pigment de la zone 111 se

Fig. 18. — Courbes d'absorption du pigment jaune orange après addition

d’acétate de zinc (—) dans le chloroforme, (—) dans l’alcool absolu.

manifeste aussi bien en milieu neutre ou acide qu’en présence du complexe

zincique. Signalons que A. Comfout a fait paraître récemment (123) une

note succincte sur un pigment jaune des coquilles d’//. cracherodii ; ce

Source : MNHN, Paris

PIGMENTS 1ÉTRAPYRROMQUES

biochrome, isolé par chromatographie sur talc, montre certaines analogies

spectroscopiques avec notre produit jaune orange, dont il se distingue

cependant par la fluorescence orange de son complexe zincique.

Additionnée de quelques gouttes d’une solution alcoolique d’iode à 1 %,

la liqueur alcoolique du complexe zincique devient verte puis bleue. Elle

présente le spectre caractéristique à deux bandes des sels de zinc des purpu¬

rines, l’une principale à /. 665 ni(x , l’autre plus faible à ). 615 m» (fig. 19).

Ce spectre est identique ii celui, observé dans les mêmes conditions, avec le

pigment vert de la zone 1 ; aucune fluorescence n’est visible en lumière

ultra-violette. Cette identité des spectres est en faveur de la filiation de ces

•leux bilirubinoïdes.

Fio. 10. — Courbe d’absorption du

pigment jaune orange après addition

d’acétate de zinc et d’iode.

Fio. 20. — Courbes d’absorption du pigment-

jaune orange d 'H. ru! encens, (—) solution

chloroformique neutre, (-. -. -) solution

chloroformique acide, (- - -) sel do zinc.

Dans une recherche fragmentaire sur les pigments d’Haliotis rufescens,

uous avons isolé par chromatographie sur alumine un pigment vert, dont

Uous avons parlé antérieurement, et un biochrome jaune orange. La solu¬

tion chloroformique de ce dernier est jaune d’or ; elle montre les mêmes

Phases colorées de la réaction de Gmelin que le pigment de la zone III.

Avec l’acétate de zinc et l’iode, elle donne également une liqueur bleue non

fluorescente. Les courbes d’absorption des solutions chloroformiques neutre

e t acide présentent un maximum à ). 440 m^ et une inflexion vers ), 480 m^

(%. 20). Le maximum du complexe zincique se situe à ), 460 m^. Cette étude

Préliminaire permet de déceler de grandes analogies entre les pigments

jaune orange d’//. rulescens et d’H. cracherodii.

4° Pigment de la zone IV.

Ayant séparé ce pigment par chromatographie, puis par précipitation

Source : MNHN, Paris

R. TIXIER

sous forme de chlorhydrate, l’ayant à nouveau chromatographie puis pré¬

cipité par l’éther de pétrole, nous pensons l’avoir obtenu à l’état pur et nous

proposons de lui donner le nom d’HALionvioLiNE. Signalons que certains

pigments biliaires, par exemple la bilifuscine et la mésobilifuscine, n’ont

pu être ni isolés, ni synthétisés à l’état cristallisé.

L’haliotivioline, isolée sous forme d’ester méthylique, est très soluble

dans l’alcool méthylique et le chloroforme, peu soluble dans l’éther, inso¬

luble dans l’éther de pétrole. Ces solubilités sont comparables à celles des

esters méthyliques des pigments biliaires.

Les analyses élémentaires, effectuées, les unes à Oxford, les autres à

Zurich, sur des produits provenant de deux préparations différentes, ont

fourni les résultats suivants :

1° pour C et H :

Prise d’essai

Hjü

CO a

en mg.

3,745

2,180

8,370

3,816

2,050

8,466

H %

60,96

6,5

60,54

6,01

Prise d’essai

Volume d’N

N %

en mg.

en cm®

3,281

0,219

7,35

Les chiffres trouvés C % : 60,90 et 60,54 ; H % 6,5 et 6,01 ; N % 7,35

s'accordent avec les formules :

^38 1, 44 °iï !N 4- calculé : C % 60,93 ; H % 5,92 ; N % 7,48 ;

C m H w O„N 4 , calculé : C % 60,77 ; H % 6,18 ; N % 7,46 ;

«•ss'Us 0 »^- calculé : C % 60,61 ; H % 6,43 ; N % 7,44 :

< '39 ! I 4s O ia N 4 , calculé : C % 61,38 ; H % 6,08 ; N % 7,34 ;

( ; 89 n 48°ia N 4 , calculé : C % 61,23 ; H % 6,33 ; N % 7,32.

Le dosage des groupements méthoxyle, effectué sur une prise de 1,093 mg.,

donne une teneur de 11,87 %. Ce dosage indique la présence de trois groupes

carboxyliques dans l’haliotivioline. Cependant nous pensons que la teneur

trouvée est trop faible et nous accordons plus de crédit h l’analyse chro-

matographique sur papier qui indique la présence de quatre groupements

carboxyliques.

Les formules sont voisines de celle de l’ester méthylique d’une copromé-

sobilivioline : C 39 H 48 O 10 N 4 ; elles s’en distinguent cependant par la pré¬

sence de 12 atomes d’oxygène au Hou de 10 pour une eopromésobilivioline.

Afin de savoir si l’haliotivioline avait bien une constitution tétrapyrro-

Source : MNHN, Paris

PIGMENTS TÉTBA PVRROLIQUES

lique, nous avons essayé d’en déterminer le poids moléculaire selon le pro¬

cédé de K. Rast, en employant la technique suivante : 0,62 mg. de pigment

et 9,07 mg. de camphre sont pesés à la microbalance dans un tube de 3 mm.

de large et de 20 mm. de long ; après avoir été scellé, le tube, fixé à l’extré¬

mité d’un agitateur, est plongé entièrement dans un bain d’huile à 180°,

H H

Coprom ésobilivioline I.

puis agité par rotation de façon à homogénéiser le mélange fondu ; après

refroidissement, le tube est ouvert, puis le mélange introduit dans des tubes

capillaires, à l’intérieur desquels il se répartit sous forme de fins copeaux ;

les tubes capillaires scellés sont prêts pour l'examen du point de fusion.

Le mélange fondu étant trop coloré pour pouvoir déterminer le point de

fusion par transparence, nous avons noté l’instant où le mélange commence

:| couler le long des parois (171°5) et le moment où tout le liquide se rassem¬

ble au fond du tube capillaire (172°). L’abaissement de température observé

entre le point de fusion du camphre utilisé (176°5) et celui du mélange est

compris entre 4°5 et 5°, ce qui indique que le poids moléculaire de l’halio-

•ivioline se situe entre 720 et 800. Ces chiffres sont en accord avec les for¬

mules proposées : calculé pour C 38 H <6 O ia N 4 : 750, et pour <' 39 1I 48 0 13 N 4 : 764.

Les teneurs en C, H et N de l’haliotivioline sont voisines de celles trouvées

pour la turboglaucobiline : C % 59,46 et 59,72 ; H % 6,22 et. 6,31 ; N % 7,52.

Les deux pigments possèdent 12 ou 13 atomes d’oxygène dans leur molé¬

cule et semblent appartenir, non à une même série, mais à deux familles

voisines de bilirubinoïdcs. En effet, alors que la turboglaucobiline possède

toutes les propriétés des pigments biliaires, ayant une structure bila-triène,

I haliotivioline et les autres biochromes d ’H. cracherodii se distinguent net¬

tement des autres bilirubinoïdes connus.

Les solutions neutres de l’haliotivioline sont rouge violet, ses solutions

ac ides bleues ; elles ne présentent les unes et les autres aucune fluorescence

n ette en lumière ultra-violette, Le pigment est partiellement enlevé à sa

s olution chloroformique par les acides dilués ; co phénomène, également

observé avec les pigments des coquilles de Turbo, ne se produit pas avec les

biochromes de la série bilirubinique.

Avec l’acide nitrique nitreux, la solution chloroformique acide bleue vire

811 violet et au rouge ; elle ne donne pas les phases ultérieures orange et

Jaune de la réaction de Gmclin.

Additionnée d’acétate de zinc, la solution chloroformique neutre passe au

bleu indigo, mais clic ne montre aucune fluorescence ou lumière ultra-vio-

Source : MNHN, Paris

». TIXIER

lette. Celte absence de fluorescence, commune à tous les pigments A'H. cra-

cherodii, distingue l’haliotivioline des bilirubinoïdcs du groupe des violines,

dont les sels de zinc présentent une intense fluorescence rouge. Cependant,

ainsi que nous le verrons ultérieurement, l’étude des produits d’oxydation

et de réduction de l’haliotivioline confirme la nature tétrapyrrolique el la

structure bila-diène (a, b) de ce pigment (voir page 64).

Spectres d’absorption.

a) Solutions neutres :

L’examen au spectrophotomètre de Beckman d’une solution d’halioti-

violine (17 y par cm*) dans l’alcool absolu montre l’existence de trois bandes

200 300 400 500 600 Jiryj.

Fig. 21. — Courbes d’absorption de l’haliotivioline, (—) dans l’alcool absolu,

(- - -) dans le chloroforme.

d’absorption dans l’ultra-violct (lig. 21). Le maximum de la bande princi¬

pale se situe à ). 240 m^ (e sp = 33) et les maxima des deux bandes secon¬

daires à /. 270 m^ (e sp = 23) et à /. 300 m^ (e sp = 24). La solution chlo¬

roformique présente également une bande principale à >, 245 m^ (esp = 30),

mais une seule bande secondaire à /, 305 rat* (s sp = 21) (fig. 21).

Les maxima des courbes d’absorption dans le visible se trouvent respec¬

tivement à }. 560 m^ (e sp = 53) pour la solution alcoolique et à ), 555 m^

(e sp = 47) en milieu chloroformique (fig. 21). Rappelons que le coeffi¬

cient d’extinction spécifique est calculé d'après la formule : e sp = —L- 5,

où c est la concentration de pigment en grammes par litre, d l'épaisseur de

la cuve et 5 la densité optique,

b) Solutions acides :

Le précipité du chlorhydrate d’haliotivioline, obtenu par passage de gaz

PIGMENTS TÉTHAI'YRROLIQUES

chlorhydrique sec dans un mélange de chloroforme cl d’éther, est lavé à

à l’éther puis séché sous vide. Ses solutions (9 y par cm*) alcoolique bleue

et chloroformique bleu-vert ne présentent aucune bande d’absorption carac¬

téristique dans l'ultra-violet, mais seulement des inflexions vers X 280 m«

et X310 mjjt ou X 320 (fig. 22). Dans le visible les courbes d’absorption,

identiques par les deux solvants (alcool et chloroforme), montrent un maxi¬

mum à X 625 mu (g sp = 52 et 50) (fig. 22).

Pio. 22. — Courbes d’absorption du chlorhydrate Fig. 23. — Courbe d’absorption

do l’baliotivioline, (—) dans le chloroforme, du complexe zincique de l’ha-

(- • -) dans l'alcool absolu. liotivioline.

c) Sel complexe de zinc :

Si quelques gouttes d’une liqueur alcoolique d’acétate de zinc à 1 %

s °nt ajoutées à la solution chloroformique neutre, cette dernière vire au

ble u indigo et présente alors dans le visible une courbe d’absorption dont

maximum se situe à X 603 m^ (fig. 23).

Les caractéristiques de la mésobilivioline ( 83 ) et de l’fialiotivioline sont

données dans le tableau suivant :

Composé

Mésobilivioline

* (chlorhydrate)

8 (sel de zinc)

Maliotivioline

8 (chlorhydrate)

8 (sel de zinc)

Solvant

Couleur

Max. d’absorption

chloroforme

violet-rouge

X 570

chloroforme

bleu

X 607 mjx

méthanol

bleu (fluo. rouge)

X 625 mjx

X 575 nqt

chloroforme

violet-rouge

X 560 ni|i

chloroforme

bleu-vert

X 625 mjx

chloroforme

bleu indigo

(pas de fluo.)

X 603 m,i

Source : MNHN, Paris

88 B. TIXIEIt

Les bandes d’absorption de ces deux pigments se situent dans les mômes

régions du spectre ; cependant, alors que les maxima des complexes zinciques

de l’haliotivioline et de la mésobilivioline se trouvent respectivement à

X 603 et X 625 m^ ceux des solutions acides sont inversement h X 625 m^

pour le premier de ces pigments et à X 607 m^ pour le second.

Oxydation.

Le fait que le pigment principal d'ïlaliolis cracherodii ne donnait pas une

réaction de Gmelin typique a été invoqué par A. Comfort ( 122 ) pour justi¬

fier la nature indigotique de ce biochrome, le produit final de la réaction

présentant un spectre comparable à celui de l’uroroséine. En réalité, cette

N N N N

H H

Mésobilivioline IX*.

observation ne peut être invoquée contre la nature tétrapyrrolique de l’halio-

tivioline, car les bilirubinoïdes du groupe des vlolines ne donnent pas la

réaction de Gmelin. C’est ainsi que la mésobilivioline s’oxyde en oxo-uro-

biline, dont les propriétés sont comparables à celles de l’urobiline (couleurs

des solutions, spectres, fluorescence verte du complexe zincique) ( 83 ).

Additionnées d’acide nitrique, les solutions d’haliotiviolinc virent au

violet, puis au rouge. Après neutralisation, ces solutions, devenues oranges,

Source : MNHN, Paris

PIGMENTS TÉTRAPYRttOLIQUKS

donnent avec l’acétate de zinc un complexe rouge cerise non fluorescent.

Ainsi que nous l’avons déjà signalé, l’absence de fluorescence des sels com¬

plexes est particulière à cette série de pigments.

La solution acide rouge présente une courbe d'absorption dont le maximum

se situe à X 530 m^ (fig. 24). Cette courbe est comparable à celle donnée

P ar A. Comfort ( 122 ) pour le dérivé rouge du pigment d 'Haliolis, elle est

différente de celle établie par W. R. Fearon et VV. A. Boggust ( 126 ) pour

le sulfate d’uroroséine (maximum principal à X 484 m^ et maximum secon¬

daire à X 535 niji (fig. 25). En outre l’uroroséine ne donne pas de complexe

linéique et ses propriétés générales sont nettement différentes de celles des

pigments biliaires. Il nous semble aventureux d’attribuer une structure

'ndigotique au pigment principal d’H. craaherodii en se basant uniquement

8l| r quelques vagues analogies de spectres, alors que toutes les propriétés

de ce pigment sont en accord avec une structure tétrapyrrolique. Il nous

Parait plus vraisemblable d'assimiler le produit d’oxydation rouge de l’halio-

tivioline à une oxo-urobiline, malgré l’absence de fluorescence du complexe

Zincique.

Réduction.

1 ° Réduction avec l'hydrosulfile de sodium :

Cette réduction, qui conduit à un pigment jaune orange, identique à

celui de la zone III, apporte une nouvelle preuve de la nature tétrapyrrolique

d® l’haliotivioline.

Agitée avec de l'hydrosulfite de sodium et de l’eau distillée, la solution

chloroformique bleu-vert du chlorhydrate d’haliotivioline vire rapidement

au jaune-vert, puis au jaune orange. Après décantation, la couche chloro¬

formique est lavée à l’eau distillée, puis avec une liqueur alcaline décinor-

^ole. Elle est ensuite filtrée sur une colonne d’alumine, qui fixe les pigments

dans sa portion supérieure. Lorsque la proportion d’alcool méthylique,

ajoutée au chloroforme, est de 3 %, une zone rouge orange principale se

détache et descend, tandis que le pigment violet, non transformé, reste

fixé en haut de la colonne, la solution jaune d’or, qui filtre, est recueillie,

Pois distillée sous vide.

La solution alcoolique du résidu d’évaporaLion est d’une teinte brun

ro uge terne ; la solution chloroformique concentrée est rouge orange, diluée

elle devient jaune d’or.

Avec l’acide nitrique nitreux, les solutions passent du jaune au vert,

Puis au bleu, au violet, au rouge et à l’orange, donnant ainsi les mêmes

Phases colorées du test de Gmelin que le pigment de la zone III.

Additionnée d'acétate de zinc et d’iode, la solution chloroformique jaune

d or vire progressivement au vert, puis au bleu. Bien que présentant la

‘ouleur et le spectre à deux bandes des complexes zinciques des purpurines,

c ette liqueur ne montre aucune fluorescence rouge. Cette absence de fluo-

Source : MNHN, Paris

1U0 B. TÏXIEB

rescence au cours de la réaction iodo-zincique a déjà été signalée pour le

pigment jaune orange de la zone III et pour le biochrome vert de la zone I.

Par acidification la liqueur bleue devient violette, montrant ainsi la couleur

des solutions acides des purpurines (phase violette de la réaction de Gmelin).

Spectres d’absorption :

Les solutions de ce pigment jaune orange montrent des modifications

spectroscopiques identiques à celles observées avec le biochrome de la

zone III, quand la polarité du solvant varie. C’est ainsi que la solution chloro¬

formique jaune d’or possède une bande principale dont le maximum se

situe à X 440 ny et une inflexion à X 480 ny (fig. 26), tandis que la courbe

d’absorption du pigment dans l’alcool absolu montre un maximum à X 495 ny

et seulement un accident à X 445 ny (fig. 26).

0,7

0,5

0,3

0,1

Fie. 20. — Courbes <1 absorption

du pigment jaune orange, pro¬

venant de la réduction do l’ha-

liotivioline, (—) dans lo chlo¬

roforme, (- - -) dons l’alcool.

Le spectres des solutions acides jaune-vert sont comparables à ceux

obtenus en milieu neutre : les maxima des courbes d’absorption se situant

respectivement à X 440 ny pour la liqueur chloroformique et à X 495 ny

quand le solvant est de l’alcool absolu (fig. 27). L’amorce d'une nouvelle

bande dans la région rouge du spectre est due à la formation du pigment vert.

Les changements de coloration et de spectres, provoqués par l’addition

d’acétate de zinc aux solutions neutres de ce pigment, sont identiques à

ceux obtenus dans les mêmes conditions avec le biochrome de la zone III-

Les maxima des courbes d’absorption se situent respectivement à X 460 ny et

X 530 ny pour la solution chloroformique et à X 490 ny et X 535 ny en

milieu alcoolique (fig. 28). L'addition d’une goutte d’alcool méthylique aux

Source : MNHN, Paris

PIGMENTS TÉTUAPYitBOLIQU ES

loi

solutions du complexe zincique provoque le virage de la teinte rouge au

jaune-vert avec apparition des spectres des liqueurs acides.

La réaction iodo-zincique donne des résultats également identiques à

ceux observés avec le pigment de la zone 111 : passage progressif de la teinte

r °uge au vert et au bleu, apparition d’un spectre caractérisé par les deux

bandes d'absorption des complexes zinciques des purpurines, absence de

fluorescence rouge. Le maxima principal se trouve à ). 665 m^ et le maximum

secondaire à ), 615 m,, (fig. 29).

Chromatographie mixle :

Les propriétés du pigment jaune orange, obtenu par réduction de l’halio-

lv ioline, étant analogues à celles du biochrome de la zone III, nous avons

Procédé à un essai de chromatographie mixte pour vérifier l'identité de ces

deux bilirubinoïdes.

Après avoir préparé trois colonnes d’alumine identiques, nous avons

Promutographié sur l’une la solution chloroformique du pigment de la

° ne HL sur l’autre celle du pigment jaune orange provenant de la réduction

l’haliotivioline, enfin sur la dernière le mélange de ces deux biochromes.

°us les trois cas les pigments sont retenus à la partie supérieure des colonnes

elumine en une zone rouge orange. Du chloroforme, contenant des propor¬

tions

croissantes d’alcool méthylique, est versé sur chaque colonne. Lorsque

a teneur du chloroforme en alcool atteint 3 %, le pigment chemine dans

trois colonnes en une zone unique, située à un même niveau. Ainsi l’essai

c chromatographie mixte confirme l’identité du produit de réduction de

haliotivioline avec le pigment de la zone 111.

Source : MNHN, Paris

102 K. TIXIKK

2° Réduction avec le zinc et l'acide acétique :

L'une des objections, qui pourrait être formulée contre la nature télra-

pyrroliquc de l'haliotivioline, est l’absence de fluorescence du complexe

zincique de ce pigment. Or, il esl possible d'oblenir. à partir de rhaliolioioline,

des produits dont les sels de zinc présentent les fluorescences Ig piques des com¬

plexes des pigments biliaires.

La solution acétique bleue du chlorhydrate d’haliolivioline, contenant

de la poudre de zinc, est chauffée avec précaution de façon à provoquer le

dégagement d’hydrogène. Peu à peu la solution passe au vert, au brun rouge,

puis au jaune pâle. Après fillration, la solution se réoxyde instantanément

par agitation à l’air et peu à peu vire au brun rouge, puis au rouge violet,

en même temps apparatl une intense fluorescence orange.

Après extraction des pigments à l’aide de chloroforme, la solution violette

obtenue est lavée à l’eau distillée pour éliminer les traces de zinc, puis avec

une liqueur alcaline et finalement à l’eau distillée. La solution chloroformique

devenue rouge ne présente plus aucune fluorescence.

Après adsorption des pigments sur alumine, le chromatogramme est déve¬

loppé à l'aide de chloroforme, contenant 1 % d’alcool méthylique. Une

zone violette se détache et chemine le long de la colonne d'alumine, suivie

d'une zone orange. Lorsque ces zones colorées atteignent successivement

le bas de la colonne, les liquides colorés correspondants sont recueillis.

Nous obtenons ainsi en premier lieu une solution rouge violet, puis une

liqueur orange. Ces solutions non fluorescentes montrent, après addition

d’acétate de zinc, la première, une intense fluorescence rouge, la seconde

une fluorescence verte. En milieu acide, l’une conserve sa fluorescence

rouge, l'autre présente une fluorescence orange.

Les spectres des solutions du pigment rouge violet sont comparables à

ceux de l'haliotivioline, dont ils ne diffèrent que par les positions des maxirna,

qui se trouvent décalés d’environ 20 vers les courtes longueurs d'ondes.

Les maxirna des courbes d’absorption se situent en effet à X 540 m ^ pour

les solutions neutres, à X WM) m^ pour les solutions acides bleu-violet et

à X 580 nin pour le complexe zincique violet (fig. 30).

Ce pigment, dont le sel de zinc présente une intense fluorescence rouge,

possède vraisemblablement une constitution chimique très voisine de celle

de l’haliotivioline, puisque les spectres d’absorption restent comparables.

Par ailleurs, il s’apparente étroitement aux pigments biliaires possédant une

structure bila-diène (a, b) (voir page 64), telle que la mésobilivioline, dont

il se distingue cependant par ses spectres d’absorption.

Par cont re, les solut ions du pigment orange montrent de grandes analogies

avec celles de l’urobiline, dont les bandes d’absorption se situent dans la

même région du spectre. Les courbes d'absorption des solutions neutre

(rouge orange) et acide (rose) possèdent un maximum f» X 506 m^ ; le maxi¬

mum du complexe zincique à fluorescence verte se situe à X 482 (fig. 31).

Source : MNHN, Paris

PIGMENTS TÉTRAPYRROLIQUES

De même que dans le cas de l'haliolivioline, le maximum d’absorption

J» sel de zinc du pigment orange se trouve décalé vers les courtes longueurs

d’ondes par rapport à celui de la solution acide. C’est le phénomène inverse

est observé dans le cas de la mésobilivioline d’une part et de l’urobiline

d’autre part. Les maxima d’absorption de l’urobiline sont en effet vers

X 490 m^ pour les solutions acides et vers X 510 m^ pour le sel complexe

de zinc. Enfin, de même que pour le pigment de la zone III, les solutions

neutre et acide ont des spectres identiques.

0,4

0,2

°»1

«X> 6ÔÔ 2^1

Fia. 30. — Courbes d’absorption du

pigment rouge violet provenant de

la réduction de l’haliotivioline (—)

solution neutre, solution

acide, (- - -) complexe de zinc.

Â a

il! \

Il \

\ \

350 450 550 ■**>/*.

Fig. 31. — Courbes d’absorption du

pigment orange provenant de la

réduction de l’haliotivioline, (—)

solution neutre, (- - -) solution

acide, (-. -) complexe «linéique.

Ainsi par réduction, puis réoxydation spontanée à l’air, l’haliotivioline

conduit à des pigments dont les sels de zinc sont fluorescents. Cette obser-

v ation apporte une preuve supplémentaire de la structure tétrapyrrolique

de l’haliotivioline et de sa parenté chimique avec les bilirubinoïdes du groupe

de 8 violincs.

5° Pigment de la zone V.

Après séparation des pigments correspondant aux zones antérieures, il

es t possible d’obtenir de nouvelles zones colorées en lavant la colonne d’alu-

* nine à l’aide de chloroforme, contenant des proportions croissantes d’alcool

^thylique (5 puis 10 %). Les solutions rouge et violette, recueillies au

as <1° la colonne, ne sont que des mélanges de pigments, d’ailleurs à l’état

Ç traces. Additionnée d’acétate de zinc, la solution rouge présente, après

v >rage au violet, une fluorescence verte ; acidifiée, elle prend une teinte

V(!r te. Les maxima d’absorption des solutions neutre et acide se situent

respectivement à ). 475 m^ et l Ü25 m«, celui du complexe zinciquc à

Source : MNHN, Paris

104

U. TIXIËR

X 605 in^. Ces spectres sont comparables à ceux de l’haliotivioline. Ainsi,

à côté des pigments principaux, étudiés antérieurement, dont l'une des

caractéristiques est de donner des complexes zinciques non fluorescents,

il existe des traces d’un biochrome dont le sel de zinc présente une intense

fluorescence verte.

c) CHROMATOGRAPHIE SUR PAPIER

R. E. H. Nicholas et C. Rimington, appliquant la chromatographie de

partage sur papier à l’étude des porphyrines (78, 79), préconisent l’emploi

du système lutidine-eau en présence de vapeurs ammoniacales. L’empla¬

cement des taches colorées sur la bande de papier (Whatman n° 1) dépend

du nombre de groupes carboxyliqucs des porphyrines étudiées, le Rf (rapport

entre la distance parcourue par la porphyrine et celle parcourue par le

solvant) étant inversement proportionnel au nombre des fonctions acides.

Quelques-unes des valeurs de Rf, trouvées par ces auteurs pour des porphy¬

rines à nombre différent de groupes carboxyliqucs, sont reportées’ dans le

tableau suivant:

Porphyrines

Nb de groupes

carboxyliques

Valeurs de

Uro porphyrine.

. . S

0,3

Coproporphyrine.

. . 4

0,6

Protoporphyrine.

. . 2

0,8

Deutéroporphyrinc . . . .

. . 2

0,8

Mésoporphyrinc.

0,8

Hématoporphyrine . . . .

0,8

Porphyrines estérifiées. . ,

. . . O

1,0

R. E. H. Nicholas et C. Rimington donnent quelques exemples d’appli¬

cation de leur technique à l’examen des porphyrines contenues dans des

milieux naturels ou des liquides pathologiques. Cette méthode est également

utilisée par R. E. H. Nicholas et A. Comfoht (80 pour l’étude des por¬

phyrines des coquilles de diverses espèces de Mollusques. Préalablement

purifiées par adsorption sur talc, puis éluées avec de l’ammoniaque 10 N,

les porphyrines sont disposées sur la bande de papier. Des traces de copro-

porphyrine peuvent ainsi être décelées, ù côté de l'uroporphyrinc, dans les

coquilles de Pinclada vulgaris. Les valeurs de Rf données par R. E. H. Nicho¬

las et A. Comfort sont pour la proloporphyrine de 0,75, pour la copro-

porphyrine de 0,5 et pour l’iiroporphyrine de 0,07 (0,12), celle dernière

porphyrine donnant deux taches colorées.

L’application de la chromatographie de partage sur papier aux pigments

biliaires nous semble devoir fournir d’utiles renseignements sur la constitu¬

tion chimique d'un grand nombre de bilirubinoides naturels, dont l’étude

est rendue délicate par le manque de matière première.

L’intérét de cette technique réside dans le fait qu'il suffit de quelques

Source : MNHN, Paris

PIGMENTS TÉTBAPYBROLIQUES

gamma de substance pour : 1° déterminer le Rf du pigment étudié et

avoir ainsi une caractéristique pouvant servir à son identification ;

2 ° connaître le nombre de groupes carboxyliques contenus dans sa molé¬

cule ; 3° vérifier son homogénéité, cette technique permettant non seule¬

ment de distinguer la présence de biochromes à nombre de groupes carbo¬

xyliques différents, mais dans certains cas de séparer des bilirubinoïdes

voisins (bilirubine et biiivcrdinc par exemple).

En premier lieu, nous avons chromatographié diverses porphyrines et

comparé nos résultats à ceux des auteurs précédents. Nous étant ainsi assuré

de la valeur de la technique employée, nous avons chromatographié simulta¬

nément des porphyrines (protoporphyrine et mésoporphyrine) et des pig¬

ments biliaires (bilirubine et biliverdine) ayant un nombre identique de

radicaux propanoïques. Ces essais ayant montré que le comportement des

pigments biliaires est analogue à celui des porphyrines, nous avons finale¬

ment procédé à l’examen des bilirubinoïdes des coquilles de Turbo et d ’Ha-

liolis.

Fig. 32. — 1. Lutidine saturée d'eau ;

2. Eau saturée de lutidine ; 3. Lest ;

4. Emplacement de la tache colorée ;

5. Support du tube à essais ; 6. Bande

de papier ; 7. Bande adliésive ; 8. Bou¬

chon de liège.

Comme les auteurs précédents, nous employons le système lutidine-eau,

mais en utilisant la chromatographie ascendante et un dispositif simplifié

(%. 32).

second tube (hauteur : 60 mm., diamètre : 17 min.), renfermant G cm* de

mtidine saturée d'eau. Le pigment, dissous dans de l’ammoniaque approxi¬

mativement 10 N, est prélevé à l’aide d’une pipette très fine et déposé à

environ 60 mm. de l’extrémité inférieure d’une bande de papier Whatman

n ° 1 (longueur 230 mm., largeur 9 mm.) en une tache de 3 mm. de diamètre,

^ette bande de papier, lestée à l’aide de deux attaches métalliques à sa

Partie inférieure, est fixée par son extrémité supérieure au bouchon de liège

Mémoires du Muséum, Zoologie, b V. 8

Source : MNHN, Paris

îoo

R. TIXIER

à l’aide d'une bande adhésive. Elle est introduite dans le tube à essais de

telle sorte qu’elle plonge dans la lutidine saturée d'eau sans toucher aux

parois du petit tube ; puis le bouehon est enfoncé soigneusement. Au bout

de quatre heures environ, la bande de papier est sortie du tube à essais,

séchée et examinée.

Ce dispositif, employé en série (six tubes par exemple), permet de travail¬

ler rapidement et de ne manipuler que de faibles quantités de lutidine

(mélange de 2-4 et de 2-5 diinéthylpyridine). Signalons que L. B. Roc-

kland etM. S. Dunn ( 127 ) ont préconisé pour l’étude des acides aminés un

système encore plus simple, puisqu’il consiste en un seul tube à essais ren¬

fermant du phénol saturé d’eau, l’extrémité supérieure du papier étant

assujettie entre le bouchon et les parois du tube.

Les valeurs de Rf des diverses porphyrines étudiées sont comparables

à celles données par R. E. H. Nicholas et A. Comfort (80) ; elles sont

consignées dans le tableau suivant :

Porphyrines

Mésoporphyrine IX.

Hématoporphyrine IX ... .

Deutéroporphyrinc IX ... .

Protoporphyrine IX.

Uroporphyrine I.

Nb de groupes

carboxyliques

Valeurs de Rf

0,74 •

0,73

0,70

0,09

0,05

Les valeurs de Rf trouvées pour les porphyrines à deux groupes carbo¬

xyliques sont voisines, mais cependant différentes ; contrairement aux

constatations de R. E. H. Nicholas et A. Comfort, nous n’avons obtenu

qu’une seule tache colorée pour l’uroporphyrine I.

Nous avons observé pour les pigments biliaires, ayant deux groupes carbo¬

xyliques, des Rf semblables à ceux des porphyrines possédant deux fonc¬

tions acides. Les emplacements sur une môme bande de papier des taches

colorées de la bilirubine (Rf = 0,75) et de la biliverdine (Rf = 0,70) sont

nettement distincts.

Pour étudier la Lurboglaucobiline, l'haliotivioline et l'ensemble des pig¬

ments A'Haliolis cracherodii, nous avons saponifié leurs esters méthyliques

à l'aide d’une solution alcoolique de potasse à 0,5 % (15 minutes à 60°).

Etendue d’eau puis acidifiée par quelques gouttes d’acide acétique, la solution

alcoolique est agitée avec du talc qui adsorbe les pigments. Après centrifu¬

gation ou essorage, ce dernier est lavé avec de l’eau, puis avec une solution

légèrement ammoniacale. Les biochromes étant élués avec de l’alcool ammo¬

niacal, la solution colorée obtenue est évaporée sous vide et le résidu repris

par 1 goutte d’ammoniaque.

Les valeurs de Rf obtenues avec la turboglaucobiline (0,45), l’halio-

tiviolinc (0,50) et l’ensemble des pigments A'Haliolis cracherodii (0,51) sont

comparables à celle donnée par R. E. H. Nicholas et A. Comfort pour le

Source : MNHN, Paris

PIGMENTS TÉTRAPYRBOLIQUES

107

Hf de la eoproporphyrine (0,5). Cos résultats non seulement confirment la

présence de quatre groupes carboxyliques dans la turboglaucobiline, mais

encore indiquent l’existence de quatre fonctions acides dans l’haliotiviolinc

et dans les autres pigments d'Haliolis craclierodii.

L'ensemble des résultats obtenus avec les porphyrines et les pigments

biliaires est schématisé dans la figure 33.

•O. 33. — 1 : mésoporphyrine IX ; 2 : hématoporphyrine IX ; 3 : doutéroporphyrine IX ;

4 : protoporphyrine IX ; 5 : uroporphyrine I ; 6 : bilirubine s 7 : biliverdine ; 8 : haliotl-

violine ; 0 : pigmente d’Haliolis ; 10 : turboglaucobiline.

d) CONCLUSIONS

En dehors du pigment principal rouge violet, auquel nous avons donné le

n om d’haliotivioline, l’analyse chromatographique sur alumine permet de

séparer trois autres fractions colorées : l’une jaune orange, l'autre verte et la

dernière violette. Ces divers biochromes sont étroitement liés les uns aux

entres et constituent une nouvelle série de pigments biliaires. C’est ainsi que

ta réduction de l’haliotivioline à l’aide d’hydrosulfite de sodium conduit à un

P*gment jaune orange, dont les propriétés sont entièrement comparables à

Ce lles du biochrome naturel jaune orange. L’analyse chromatographique du

Mélange de ces deux bilirubinoïdes permet de conclure à leur identité. De

•nêine, un pigment jaune orange, semblable aux précédents, est obtenu par

r éduction du biochrome verL à l’aide d’hydrosulfite de sodium. Enfin le

P'gment violet présente des propriétés analogues à celles de l’haliotivioline

ç t seule l’analyse chromatographique permet de distinguer ces deux bio-

c bromes, probablement isomères. En outre une étude préliminaire montre

ex istence d’une certaine parenté entre les pigments d 'H. rufescens et d ’H.

Cr dcherodii.

Source : MNHN, Paris

108

». T1X1KR

Par l'ensemble de ses propriétés, le biochrorne vert s’apparente aux bili¬

rubinoïdes du groupe des verdines (bila-triènes) ; le pigment jaune orange

entre dans la classe des rubincs (bila-diènes (a, e)) ; enfin les pigments violets

présentent les propriétés des violines (bila-diènes a, b)) (voir page 64). (les

bilirubinoïdes se distinguent cependant des autres pigments biliaires naturels

par certaines particularités.

C’est ainsi que l’une des caractéristiques du pigment jaune orange réside

dans le changement de teinte et les modifications spectroscopiques pré¬

sentées par ses solutions suivant la polarité du solvant. Des constatations

analogues ont été signalées chez les caroténoïdes, possédant une (onction

cétone en conjugaison avec une chaîne latérale ayant plusieurs doubles

liaisons (rhodoxanthine) ( 125 ). 11 est ainsi permis de penser à l'existence

d’une fonction cétonique dans le pigment jaune orange, qui, comme tous les

bilirubinoïdes, possède un grand nombre de doubles liaisons. Des spectres

analogues sont présentés par le pigment jaune orange d 'H. rufescens.

Une autre particularité des pigments d 'II. cracheroclii est l’absence de

fluorescence de leurs sels de zinc.. A notre connaissance, aucune constatation

de cet ordre n’a encore été signalée chez les pigments biliaires naturels.

Parmi ceux-ci, les uns ont des complexes zinciques à fluorescence verte

(urobiline) ou rouge (inésobilivioline), les autres (bilirubine ou biliverdine),

dont les sels de zinc ne sont pas fluorescents, peuvent être oxydés en bili¬

rubinoïdes à complexe fluorescent (réaction iodo-zincique). A des fluores¬

cences semblables correspondent des structures chimiques analogues avec

Une distribution identique des doubles liaisons. C’est ainsi que les mésobi-

liviolines et les mésobilipurpurines ont une structure bila-diène (a, b) ; la

seule différence entre ces pigments réside dans la saturation de l'un des

ponts carbonés par deux atomes d'hydrogène dans les premiers, par un

oxygène dans les seconds. Il est évident que toute modification dans la

structure chimique, qui entraînerait la disparition de la fluorescence chez

les mésobiliviolines, la supprimerait également chez, les mésobilipurpurines.

L’absence de fluoresrencc des sels de zinc de l'haliol iviolinc, d'une part,

et des produits d'oxydation des pigments jaune orange et vert, d'autre

part, ne peut qu’être duc à une cause identique, qui doit être recherchée dans

une modification de la constitution chimique de ces biochromes par rapport

à celle des autres bilirubinoïdes naturels.

Cette modification est légère, car il est possible, en pariant de l’halioli-

violine, de passer à une nouvelle série de bilirubinoïdes d sels de zinc fluores¬

cents. 11 suffit en elïet de réduire l’haliotiviolinc b l’aide de poudre de zinc

en milieu acétique, puis de laisser la liqueur se réoxyder à l’air pour obtenir

une solution fluorescente. L’analyse chromatographiquc permet de séparer

un pigment rouge orange, dont le sel de zinc possède une fluorescence verte,

et un biochrome violet, dont le complexe zineique présente une fluorescence

rouge ; le premier de ces produits s'apparente 4 l’urobiline, le second 4 la

inésobilivioline. L'analogie des spectres d’absorption du biochrome violet

Source : MNHN,

PIGMENTS TÉTRAPYRROLIQUES

109

fluorescent et de l'haliotivioline montre que la réduction zincique n’apporte

qu’une légère modification dans la constitution chimique de l’haliotivioline.

Les relations existant entre la constitution chimique des pigments biliaires

et leur possibilité de donner des complexes fluorescents n’ont fait l’objet

d’aucune étude particulière. Cependant H. Fischer (124) a remarqué que

les esters méthyliques des bilirubines ou des biliverdines dont l’un des grou¬

pements hydroxyles en position 1' ou 8’ est remplacé par un radical métho-

xyle (voir page 88), donnent par oxydation des produits dont les sels de zinc

ne sont pas fluorescents. De môme cet auteur a fait la synthèse d’une bili¬

rubine (voir page 89) dont le carbone du pont b est lié à un noyau benzé-

nique (124) ; après addition d’acétate de zinc et d'iode, la solution alcoolique

de ce pigment présente le spectre des sels complexes des bilipurpurincs,

mais aucune fluorescence n’apparaît. Dans les deux cas, le remplacement

d’un hydrogène, soit dans un des groupements hydroxyles, soit dans un pont

carboné, par une liaison avec un atonie de carbone détermine la dispa¬

rition de la fluorescence des sels de zinc. Dans le cas des pigmenls^d ’Haliolis

il est permis de penser que l’absence de fluorescence est duc «i une cause

analogue et que la réduction zincique ou bien rest aure un groupe — OH en

position 1’ ou 8’, ou bien restitue un hydrogène :’i un pont carboné.

Bien que nous n'ayons pu obtenir l’haliotivioline à l’état cristallisé, nous

pensons l’avoir isolée à l’état pur, grâce à l’analyse chromatographique et

à des précipitations successives, ltappelons que certains pigments biliaires,

tels que la bilifuscine et la mésobilifuscinc, n'ont pu être ni isolés, ni synthé¬

tisés à l’état cristallisé, La nature létrapyrroliquc du pigment principal

d'//. cracherodii a été mise en douLc par divers auteurs (118) (122), qui lui

ont attribué une structure indigotique. Cependant, ayant pris connaissance

des résultats que nous avions obtenus, A. Comfout vient de reconnaître la

nature létrapyrroliquc du pigment principal à'H. cracherodii (123).

Il nous semble qu'aucune contestation ne puisse dorénavant subsister

S| ir la parenté de l’haliotivioline avec les pigments biliaires. En effet la struc¬

ture tétrapyrrolique de ce biochrome est confirmée par son analyse élémen¬

taire, par la détermination de son poids moléculaire, par sa réduction soit

en pigment, donnant la réaction de Gmelin, soit en bilirubinoïdes dont les

complexes zinciques sont fluorescents.

Les formules pouvant être attribuées à l’haliotivioline (voir page 94)

sont voisines de celle d’une copromésobilivioline (C39H48O10N4) (voir pages

94 et 95), dont elles se distinguent principalement par la présence de deux

atomes d’oxygène supplémentaires. La teneur en groupements méthoxyle

s’accorde avec la présence de trois fonctions carboxyle ; toutefois nous

pensons que ce dosage, effectué sur 1 mg. 9 de pigment, manque d’exacti¬

tude et nous accordons plus de crédit â la chromatographie sur papier qui

ln dique l’existence de quatre fondions acides. L’analyse élémentaire de

l’haliotivioline donne des résultats extrêmement voisins de ceux trouvés

pour la turboglaucobiline. Ces deux pigments possèdent 12 ou 13 atomes

Source : MNHN, Paris

110

B. T1X1EB

d'oxygène dans leur molécule et leur constitution chimique est probablement

très voisine, quoique différente. En effet, la turboglaucobiline présente toutes

les propriétés des verdines, alors que l’haliotiviolinc se distingue nettement

des autres violines par l’absence de fluorescence du complexe zincique.

Envisageant la constitution chimique de la turboglaucobiline, nous avons

émis l’hypothèse de la présence de groupements propanoïqucB, renfermant des

fonctions alcool secondaire : tels que —CH,—GHOH—GOOH ou—CHOH—

CH,—COOH. Cette hypothèse est également valable pour l'haliol ivioline et

par conséquent pour le pigment jaune orange. Toutefois les modifications

de spectres, observées avec ce dernier biochrome, sont plutôt en faveur de

l’exiBtence d’une fonction cétonique dans les chaînes latérales des biliru-

binoïdes d ’H. cracherodii. Rappelons que le maximum d'absorption de la

mésobilirubine se situe à X 425 mj* et celui de la bilirubine à X 450 m^ ( 19 ),

le déplacement de la courbe d’absorption de ce dernier pigment vers les

grandes longueurs d’ondes étant dû à la présence de doubles liaisons (grou¬

pements vinyle) dans les chaînes latérales. Le déplacement des bandes

d’absorption du pigment jaune orange vers la partie rouge du spectre, lorsque

le solvant est polaire, s'expliquerait ainsi par l'apparition de doubles liaisons

dues à l’énolisation de fonctions cétoniques :

— CO—CH,—COOH**—C=CH — COOH.

Il est cependant curieux que nous n’ayons pu observer de modifications

spectroscopiques aussi nettes avec les autres pigments d’//. cracherodii.

Dans le cas de l’haliotivioline il faut noter toutefois l’apparition d’une troi¬

sième bande d’absorption dans l’ultra-violet lorsque le solvant est polaire

et de légers changements dans les teintes des solutions chloroformique

et alcoolique. Signalons par ailleurs un décalage important vers l’extrême

rouge des bandes d’absorption des pigments verts d ’H. cracherodii et d’/7.

rufescens par rapport è celles de la biliverdine, aussi bien dans l'ultra-violet

que dans le visible.

L’hypothèse la plus plausible pour expliquer l’absence de fluorescence

du complexe zincique de l’haliotivioline est celle d’une liaison entre l’un des

ponts carbonés et l’une des chaînes latérales. Par analogie avec les chloro¬

phylles, il est possible de penser à une constitution correspondant au schéma

Une toile constitution permet d’expliquer :

— l'absence de fluorescence des sels de zinc des pigments d'il, cracherodii

Source : MNHN, Paris

PIGMENTS TÉTRAPYRROLIQÜES

111

par suite du remplacement de l’hydrogène du pont carboné par une liaison

entre deux atomes de carbone ;

— le passage, par réduction zincique de l’haliotivioline, puis réoxydation

a des pigments biliaires dont les sels de zinc sont fluorescents, la chaîne

latérale devenant libre et le pont carboné retrouvant un atome d’hydro¬

gène ;

— les différences de comportement des sels de zinc de l’haliotivioline

de la turboglaucobiline, malgré des formules élémentaires voisines ;

— les analogies de spectres entre l’haliotivioline et le pigment violet à

fluorescence rouge, obtenu par réduction zincique et réoxydation, les diffé¬

rences entre ces deux pigments ne portant que sur la disparition de la liaison

entre le pont carboné et la chaîne latérale.

En réalité, nous devons constater qu’il serait vain, dans l’état actuel de

n os connaissances, de vouloir donner une formule de l’haliotivioline, les

hypothèses envisagées ne pouvant servir qu'à orienter un travail ultérieur.

Pour établir la constitution des pigments d ’Haliolis, il faudrait pouvoir

e n étudier les produits de transformation et de dégradation. Malheureuse¬

ment, l'un des obstacles à l’étude de ces biochromes réside dans la difficulté

d’obtenir des quantités suffisantes de produit pour en entreprendre une

^‘lude chimique plus poussée.

Source : MNHN, Paris

112

K. TI XI ER

DEUXIÈME PARTIE

ÉTUDE DES PORPHYRINES DE L AMBRE GRIS

A. — HISTORIQUE

L’ambre gris est une concrétion intestinale du Cachalot (Pliyseler macro-

cephalus). Il se présente sous forme d’amas foncés presque noirs, de taille

variable et d’odeur caractéristique. Le processus de formation de l’ambre

gris est encore très mal connu. Une revue récente de la chimie de l’ambre

gris est donnée par E. Lederer (128).

La présence, dans l’ambre gris, d’un pigment apparenté aux porphyrincs

est signalée par M. Suzuki ( 129 ) en 1925. Quelques années plus tard,

Y. Okahara (130) donne à la porphyrine le nom d’ambroporphyrine. Après

avoir extrait la porphyrine par de l'acide chlorhydrique et l'avoir purifiée

par des dissolutions successives suivies de précipitations par l’eau, l’auteur

obtient une poudre brun rouge amorphe soluble dans l’éther, l’alcool, le

chloroforme, les acides dilués et les alcalis, insoluble dans l’eau et l’éther

de pétrole. Si le spectre de ce pigment en solution élhérée est comparable

à celui de la coproporphyrine, il se montre différent en milieu alcalin. Par

estérification de la porphyrine libre à l’aide d’alcool méthylique chlorhy¬

drique, Y. Okahara obtient un produit cristallisé en aiguilles brun rouge,

réunies en houppes. Dans son livre « Die Chemie des Pyrrols » (1937) ( 131 ),

H. Fischer consacre un paragraphe spécial à l’ambroporphyrinc, qu’il

semble considérer comme une nouvelle porphyrine.

B. — RECHERCHES PERSONNELLES

La matière première utilisée est la fraction de l’ambre gris insoluble dans

l’éther ; elle représente environ 15 % du poids de l’ambre. Au cours d’une

étude préliminaire sur 20 g. de résidu d’ambre gris, nous avons isolé par

chromatographie 8 mg. d’une porphyrine que nous avons identifiée avec

la protoporphyrine IX. Puis, dans une nouvelle série d’essais, à partir de

150 g. de résidu d’ambre, nous avons séparé par chromatographie 30 mg.

de protoporphyrine et 10 mg. d’une autre porphyrine identique à la méso-

porphyrine IX. Les deux séries de recherches ayant été conduites différem¬

ment, nous pensons qu’il est utile de les exposer séparément.

Source : MNHN, Paris

PIGMENTS TÉTRAPYRROLIQÜES

113

a) ESSAIS PRÉLIMINAIRES

1° Extraction et estérification.

20 g. de résidu d’ambre sont traités par 100 cm® environ d’alcool méthy-

bque chlorhydrique à 12 % à l’ébullition pendant 5 minutes. La solution

brun foncé, séparée du résidu par filtration sur Bfichner, présente en lumière

ultra-violette une intense fluorescence rouge. Elle est additionnée de 200 cm*

de chloroforme, puis d’eau distillée ; le chloroforme se sépare en une couche

brunâtre à fluorescence rouge intense, alors que la couche aqueuse, également

brunâtre, présente une fluorescence verdâtre. La solution chloroformique

eg t décantée, lavée trois fois à l’eau distillée, deux fois avec une solution-

de carbonate de sodium à 5 % et de nouveau trois fois à l’eau distillée.

Finalement, la solution chloroformique est déshydratée avec du sulfate de

sodium anhydre.

Après filtration, la solution chloroformique est évaporée à sec et le résidu

brunâtre est repris plusieurs fois par de l’éther à l’ébullition jusqu’à concur-

re nce de 100 cm*. La solution éthérée rouge présente une intense fluores¬

cence rouge en lumière ultra-violette. Après concentration à 10 cm® environ,

die est abandonnée pendant une nuit, à la température du laboratoire. Le

Produit cristallisé, recueilli par centrifugation, est lavé avec quelques cm*

d’éther, puis recristallisé dans un mélange de chloroforme et d’alcool méthy-

bque bouillant. Les cristaux obtenus sont caractéristiques de l'ester méthy-

Hfluc de la protoporphyrinc (PF : 224°-22T)°).

2° Purification par chromatographie.

Le produit cristallisé est dissous dans la plus petite quantité possible de

chloroforme, puis la solution est additionnée de 25 cm* de benzène et de

cm* d’éther de pétrole. Le mélange est filtré sur une colonne d'alumine

flui fixe les pigments dans sa portion supérieure. Le chromatogramme est

développé à l’aide d’un mélange d’un volume de chloroforme pour 4 volumes

d éther de pétrole. Une zone rose se forme et descend le long de la colonne

d alumine. Cette zone principale est précédée d’une mince zone violacée.

Lorsque la zone principale atteint le bas de la colonne, le liquide coloré,

fioi filtre, est recueilli.

Par évaporation de cette solution, la porphyrine cristallise au sein du

s °lvant sous forme de losanges arrondis aux angles. Ces cristaux sont recueillis

Pai' centrifugation, puis desséchés sous vide. Nous obtenons ainsi 8 mg. de

P*gment cristallisé.

3° Identification.

Les divers aspects cristallins de la porphyrine ainsi isolée sont comparables

^ c eux de l’ester méthylique de la protoporphyrine observés dans des condi-

>ons identiques de cristallisation. Son point de fusion est de 224°-225°.

R. TIX1ER

114

Le mélange de ce pigmenL et do l’ester inéthylique de la protoporphyrinc

ne montre aucun abaissement du point de fusion (224°-225°).

Le spectre d'absorption dans le visible de la solution chloroformique est

superposable à celui de l’ester méthylique de la protoporphyrine : I X 630 mp ;

Il X 575 mp ; III X 539 mp ; IV X 504 mp.

Enfin, la chromatographie sur alumine d’un mélange de ce pigment et

de l'ester méthylique de la protoporphyrine ne donne qu’une seule zone

colorée.

b) ESSAIS DÉFINITIFS

1° Extraction et estérification.

150 g. de résidu d’ambre gris (correspondant à environ 1 kg. d’ambre)

sont traités par 1 litre d’alcool méthylique chlorhydrique à 10 %. Le solvant

acide restant plusieurs jours en contact avec l’ambre gris à l’obscurité, les

porphyrines sont dissoutes et estériliées. La solution alcoolique brun rouge,

séparée de la fraction insoluble par filtration sur Büchner, présente une

intense fluorescence rouge en lumière ultra-violette. La fraction insoluble

reprise par de l’alcool méthylique chlorhydrique donne une nouvelle solu¬

tion brunâtre, mais celle-ci, exposée aux rayons ultra-violets, ne présente

plus de fluorescence rouge, mais une fluorescence verdâtre.

Après distillation à sec sous vide de l’extrait alcoolique initial à fluores¬

cence rouge, le résidu est repris par du chloroforme qui dissout les porphy¬

rines. La solution chloroformique brun rouge est d’abord lavée à l’eau distillée,

puis deux fois avec une solution de carbonate de sodium à 5 %, enfin de

nouveau à l’eau distillée. Après filtration, la solution chloroformique est

déshydratée avec du sulfate de sodium anhydre.

2° Séparation des pigments par chromatographie.

Après concentration â environ 90 cm*, ln

liqueur chloroformique est additionnée d'un

égal volume d'éther de pétrole, puis le mélange

est versé sur une colonne d'alumine (150 g.).

Lorsque la solution colorée est adsorbée, nous

Continuons d’humecler la colonne d’alumine

avec un mélange fi volumes égaux de chloro¬

forme et d’éther de pétrole.

Le chromalogramme obtenu montre toute

une série de zones colorées ( fig. 34). Les zones

principales, superposées (III et IV), présentent

une intense fluorescence rouge en lumière ultra¬

violette. Les diverses zones colorées sont sorties du tube à chromatogra-

phier et sont éluées séparément à l’aide de chloroforme.

.VII brun sale

•VI brune *

,V rose brun

.IV rouge brun

.III rose

.II orange

,1 jaune

Fio. 84.

Source : MNHN, Paris

PIGMENTS TÉTRAPYRROLIQÜES

115

a) Purification de la porphyrine de la zone 111.

Le produit d’évaporation de i’éluat de la zone III est un mélange de la

porphyrine et d’une substance incolore cristallisée. Pour séparer ces deux

constituants, le produit d’évaporation est repris par un peu de chloroforme,

puis la solution est diluée avec de l’éther. La porphyrine est ensuite extraite

do la solution éthérée à plusieurs reprises avec de l’acide chlorhydrique à

^ %. Après neutralisation des solutions acides par addition d’acétate de

sodium jusqu’à virage de la teinte violette au rouge, la porphyrine est

extraite par du chloroforme. La solution chloroformique est ensuite lavée

suivant la technique habituelle avec une liqueur alcaline, puis déshydratée

*vec du sulfate de sodium anhydre.

La porphyrine de la zone III est finalement purifiée par une nouvelle

chromatographie sur alumine. Après concentration à environ 15 cm*, la

solution chloroformique est additionnée de 3 fois son volume d’éther de

pétrole et le mélange est filtré sur une colonne d’alumine (30 g.) ; le chroma-

togramme est ensuite développé à l'aide d’un mélange composé d’un volume

de chloroforme pour 3 volumes d’éther de pétrole. Une zone principale,

correspondant au pigment de la zone III, descend le long de la colonne

d’alumine, suivie d’une zone rose pâle (porphyrine de la zone IV).

La zone principale étant sortie du tube à chromatographier, la porphyrine

est éluée avec du chloroforme. Finalement, la solution chloroformique,

a prés concentration à quelques cm 8 , est additionnée d’alcool méthylique

bouillant. Par refroidissement, la porphyrine cristallise sous forme de

Petites tablettes. Nous obtenons ainsi environ 10 mg. de porphyrine cris-

ÿllisée.

b) Purification de la porphyrine de la zone IV.

La porphyrine de la zone IV est également extraite de sa solution éthérée

Par de l'acide chlorhydrique à 27 %. Après neutralisation avec de l’acétate

de sodium, la porphyrine est extraite au chloroforme, puis la solution chloro¬

formique est lavée avec une solution de carbonate de sodium à 5 % et déshy¬

dratée avec du sulfate de sodium anhydre.

Après concentration à environ 10 cm 8 , la solution chloroformique est

a dditionnée de 3 fois son volume d’éther de pétrole, puis le mélange est versé

Su r une colonne d'alumine (30 g.). Le chromatogramfne est ensuite développé

avec un mélange d'un volume de chloroforme pour 3 volumes d’éther de

Pétrole. Une zone principale descend le long de la colonne d’alumine, précédée

Un « zone rose, correspondant à un peu de porphyrine de la zone III.

L’éluaL chloroformique du pigment de la zone principale, après concen-

a Lon à quelques cm 8 , est additionné d’alcool méthylique bouillant. Par

^froidissement, la porphyrine cristallise. Nous obtenons ainsi environ 30 mg.

0 produit cristallisé.

Source : MNHN, Paris

B TIXIER

111}

3° Identification des porphyrines isolées.

a) Propriétés de la porphyrine de la zone III.

L’aspect cristallin de la porphyrine de la zone III est identique ii celui

de l’ester méthylique de la mésoporphyrine IX. Son point de fusion est

de 210°-214°. Le mélange de celle porphyrine et de l’ester méthylique de la

mésoporphyrine ne montre aucun abaissement du point de fusion (210°-

214°).

Cette porphyrine est très soluble dans le chloroforme, peu soluble dans

l’éther et l'alcool méthylique, insoluble dans l’éther de pétrole.

Les analyses élémentaires des porphyrines île l’ambre gris ont été effec¬

tuées au Laboratoire de Chimie du Muséum de Paris. L’analyse élémentaire

de la porphyrine de la zone 111 s’accorde avec la formule < : 3 «II 4 2<) 4 N 4 qui

est celle de l'ester méthylique de la mésoporphyrine.

Les résultats, fournis par deux microdosages ('., II, sont les suivants:

I‘r

isc d'essai

HgO

en mg.

3,680

2,355

3,514

2,350

c %

H %

calculé

72,69

7.11

trouvé

72,78

7,16

72.02

7,48

La courbe d’absorption dans le visible de la solution chloroformique

déterminée à l’aide du spectrophotomètre d'Yvon et Jobin, présente les

5 bandes d'absorption (I, la, II. III, IV) caractéristiques des porphyrines

dérivant des étioporphyrines. La bande la, très faible, n'est visible qu’avec

une solution suffisamment concentrée ; l'intensité de l’absorption des autres

bandes croît de 1 h IV. Les positions des maxima sont : I X 623 ny : I a

X 595 ny ; II X 567 ny ; III X 532 ny ; IV X 499 ny . Le spectre d’absorp¬

tion de l'ester méthylique de la mésoporphyrine en solution chloroformique

est identique, les positions des maxima des bandes sont comparables :

I X 623 ny ; la X 595 ny ; II X 568 ny : III X 532 m K ; IV X 499 ny.

L’identité du pigment de la zone III avec la mésoporphyrine IX est égale¬

ment établie par une chromatographie mixte. Pour cela une solution chloro¬

formique des deux pigments est additionnée de 3 fois son volume d’éther

de pétrole, puis le mélange est versé sur une colonne d’alumine. Lorsque la

solution pigmentée est adsorbée, la colonne est humectée avec un mélange

d’un volume de chloroforme pour 3 volumes d'éther de pétrole. Une seule

zone rouge se forme et descend le long de la colonne d'alumine.

Il apparaît ainsi que la porphyrine correspondant à la zone III est identique

à l'ester méthylique de la mésoporphyrine IX (voir page 56).

Source : MNHN, Paris

PIGMENTS TÉTRAPYBBOIilQU ES

117

b) Propriétés de la porpliyrine de la zone IV.

L’aspect cristallin de la porphyrine de la zone IV est identique à celui

<le l’ester méthylique de la protoporphyrine IX. Son point de fusion est

de 224°-225°. Le mélange de ce pigment et de l'ester méthylique de la proto-

porphyrine ne montre aucun abaissement du point de fusion (224°-225°).

Cette porphyrine est très soluble dans le chloroforme, peu soluble dans

■'alcool méthylique et l'éther à froid, insoluble dans l’éther de pétrole.

L’analyse élémentaire s'accorde avec celle de l’ester méthylique de la

protoporphyrine : ('•3 6 1I 3 80 4 N 4 . Le microdosage C, H, donne en effet les résu 1-

tats suivants :

«O -au 1- »■

*risc d’essai

n a o

CO,

calculé

trouvé

en mg.

3,755

0 %

73,19

72,71

en mg.

2,190

H %

6,52

6,49

en mg.

10,005

Le spectre d’absorption de celte porphyrine, en solution chloroformique,

Présente les 5 bandes (I. la. Il, 111, IV) des porphyrincs dérivant des étio-

Porphyrines. La bande la, très faible, n’est visible qu’avec une solution

suffisamment concentrée ; l’intensité de l’absorption des autres bandes

cr °lt de I à IV. Les positions des maxima sont respectivement : I X 620 ny ;

la ).602 ny ; 11 X575 ny ; III X 539 ny ; IV X 504 ny. La courbe d’absorp-

*°n de l’ester méthylique «le la protoporphyrine en solution chloroformique

es f identique et les positions des maxima sont comparables : I X 630 ny ;

Ia 602 ny : 11 X 575 ny ; III X 540 ny ; IV X 504 ny.

Une chromatographie mixte de cette porphyrine et de l’ester méthylique

•la la protoporphyrine, effectuée sur alumine et dans les mêmes conditions

Hue pour le pigment de la zone III, ne donne qu’une seule zone colorée.

Il apparaît ainsi que la porphyrine de la zone IV est identique è l’ester

méthylique de la protoporphyrine IX (voir page 55).

c) CONCLUSION

Le pigment dénommé ambra porphyrine par Y. Okahara (130) et consi¬

dère par H. Fischer (131) comme une nouvelle porphyrine est, en réalité,

Un mélange de protoporphyrine IX et de mésoporphyrinc IX. Ces deux

“•«chromes, extraits fi l’état d’esters mélhyliqucs, ont pu être séparés par

c bromatographie sur alumine. Bien qu’ayant une constitution chimique

extrêmement voisine, la protoporphyrine, qui possède deux groupes vinyle

11 lu place des deux radicaux éthyle de la mésoporphyrine, est plus fortement

a, l8orbée. Ces deux pigments ont été caractérisés par leur point de fusion,

CUr analyse élémentaire et leur spectre d’absorption dans le visible. Leur

étude a été poursuivie conjointement avec celle des esters méthyliques d’une

Source : MNHN, Paris

118

n TIXIER

protoporphyrine et d’une mésoporphyrine préparées à partir de l’hémine.

Ils ont pu ainsi être identifiés respectivement par chromatographie mixte.

A 1 kg. d’ambre gris correspond environ 30 mg. de protoporphyrine et

10 mg. de mésoporphyrine.

Signalons que la protoporphyrine IX se trouve en petite quantité dans

les fécès do l'homme et qu’elle a été signalée dans l'intestin, en particulier

lors d’hémorragie et d’ingestion de sang (131). Par ailleurs, l'hémoglobine

et le sang, attaqués par les bactéries intestinales, donnent de la protopor¬

phyrine. De même la mésoporphyrine a été isolée des fécès de malades du

foie et d’un cas de porphyrie (132) (76).

La présence de porphyrines dans l’ambre gris pourrait s'expliquer de

la façon suivante : les becs de Seiche, avalés par les Cachalots et retrouvés

dans l’ambre gris, provoquent des hémorragies dans l’intestin de ces Cétacés ; 1

l’hémoglobine est transformée par les bactéries en protoporphyrine dont

une partie est ensuite réduite en mésoporphyrine. Ainsi que nous l’avons

signalé antérieurement, la réduction des radicaux vinyliques de la proto¬

porphyrine en groupes éthyle conduit à la mésoporphyrine. Cette réduction

des radicaux vinyle des pigments tétrapyrroliques par les bactéries intes¬

tinales a surtout été étudiée dans le cas des bilirubinoïdcs (133, 134, 135).

11 semble ainsi que la formation de l’ambre gris est due à un processus patho¬

logique.

PIGMENTS TÉTRAPYRROLIQUES

CONCLUSION GÉNÉRALE

Les techniques employées pour l’extraction, la purification et la carac¬

térisation îles pigments tétrapyrroliques étudiés au cours de ce travail sont

mdiquées dans un chapiLre préliminaire. Dans les divers cas les pigments

8 °flt,en effet, extraits et estérifiés à l’aide d’alcool méthylique chlorhydrique,

Plis purifiés par chromatographie sur alumine et cristallisés dans des mé¬

langes de solvants ; l’analyse élémentaire en est ensuite effectuée et les pro¬

priétés étudiées.

Dans la première partie de cet exposé, nous examinons les porphyrines,

Puis les pigments biliaires des coquilles de Mollusques.

L’emploi de l’analyse chromatographique nous a permis d’isoler et de

Caractériser les porphyrines des coquilles de divers Mollusques appartenant

soit à la famille des Ptéridés (Pleria macroptera, P. margarilijera), soit à celle

des Trochidés (Clanculus pharaonis , Trochus viryalus et T. maculatus).

A partir de deux coquilles de Pleria macroptera sont obtenus 22 mg. de

P°rphyrine cristallisée. Par son aspect cristallin, son analyse élémentaire,

S cs spectres et ses solubilités,, cotte porphyrino s’apparente aux uroporphy-

r *ncs ; par son point de fusion et par celui de son sel complexe de cuivre, elle

8 identifie avec l’ester méthylique de l’uroporphyrine 1. Au cours de la chro¬

matographie, la présence d’uroporphyrine III n’est pas révélée.

Les coquilles de Pleria margarilijera ne renferment que des traces d’une

porphyrine dont le comportement chromatographique et le spectre d’ab¬

sorption sont comparables à ceux de l’ester méthylique de l’uroporphyrine I.

même les porphyrines isolées des coquilles de Clanculus pharaonis, de

Troclius uirgalus et de T. malaculus ont un comportement chromatographique

analogue et des spectres identiques h ceux de l’uroporphyrine de Pleria

t'acroplera.

Qes résultats, joints à ceux obtenus par H. Fischer (99, 66) et par A.

omi'oht (107), montrent que la présence d’uroporphyrine dans les coquilles

t® 8 Ptéridés est un fait général ; chez certaines espèces (P. macroplera,

• vulgaris, P. radiala), cette uroporphyrine se rencontre en quantité rela-

IV| ‘nient importante, chez d’autres elle ne se trouve qu’à l’état do traces

y ■ niargarilifera). L’existence d’uroporphyrine I dans les coquilles de la

amillc des Trochidés n’avait pas encore été signalée ; certaines espèces de

rn chu8 renferment un pigment vert présentant les caractères d’une bili-

er dine ; faute de matière première, nous n’avons pu étudier ce bilirubi-

Source : MNHN, Paris

120

tt. TlXIUU

noïdc qu’il aurait été cependant intéressant de comparer à celui du test de

Turbo.

Nous avons examiné ensuiLe les pigments biliaires des coquilles de Mol¬

lusques de la famille des Turbinidés ( Turbo Hegenfussi, T. marmoralus,

T. elegans) et des Haliolidés (Haliolis cracherodii).

A part ir de 30 coquilles de Turbo Ilegenfussi nous isolons 20 mg. d'un pig¬

ment bleu que nous proposons de dénommer lurboglaucobiline. Extrait

sous forme d’ester méthylique, puis purifié par chromatographie sur alumine,

ce pigment est obtenu à l’état cristallisé (PF 205°-206°). Il présente toutes

les propriétés des pigments biliaires, possédant, comme la biliverdine, une

structure bila-triène (couleurs et spectres des solutions, test de Gmelin et

réaction iodozincique). Cependant les maxiina des bandes d’absorption de la

turboglaucobiline dans l’ultra-violet et dans le visible ont des positions inter¬

médiaires entre ceux de la glaurobiline et de la coproglaueobiline d’une

part et de la biliverdine d'autre part.

C’esl le premier pigment biliaire de Mollusques obtenu d l'élal cristallisé.

L’analyse élémentaire s’accorde avec les formules (', 38 H 44 0 12 N 4 , C 8 gH 48 O ia N 4

et C 39 H 46 O u N 4 . Nous pensons que les formules en Cjj, qui font de ce biochrome

soit une dioxy- soit une trioxycoproglaucobiline, sont les plus vraisem¬

blables. Les deux ou trois atomes d'oxygène supplémentaires ne peuvent être

contenus que dans les chaînes latérales fixées sur les noyaux pyrroliquesen

position (3. En effet, toute substitution en position oc entraînerait une modi¬

fication de la structure bila-triène et un changement des propriétés géné¬

rales du pigment. D'après la teneur en groupements méthoxyle, confirmée

par l’analyse chromatographique sur papier, la turboglaucobiline possède

quatre fonctions acides comme une coproglaueobiline. L’analyse élémentaire

de Vhatiolivioline , pigment principal des coquilles d 'Haliolis cracherodii,

donne des résultats comparables à ceux obtenus avec la turboglaucobiline.

Tous les pigments biliaires naturels connus jusqu'à ce jour dérivaient de la

protoporphyrine ; c’est la première fois que des bilirubinoïdes, ayant une

composition voisine d’une coproglaueobiline, sont signalés dans le règne

animal.

Nous exposons les raisons qui nous font envisager l'existence de groupe¬

ments oxypropanoïques :—CHOH—GH 8 —COOHou—CH 8 —CHOH—COOH

dans la turboglaucobiline, pour laquelle nous proposons une formule déve¬

loppée. Si cette formule était confirmée, il faudrait considérer les chaînes

oxypropanoïques de la turboglaucobiline soit comme des formes de passage

entre les radicaux propanoïques et vinyliques, soit comme des groupements

précurseurs de ces radicaux. Toutefois cette formule ne doit être considérée

momentanément que comine l’hypothèse de travail la plus probable, la

quantité de pigment obtenu n’ayant pas permis d'étudier les produits de

dégradation de la turboglaucobiline.

La présence de turboglaucobiline est également mise en évidence dans le*

coquilles de Turbo marmoralus et île T. elegans.

Source : MNHN, Paris

PIGMENTS TÉTBAPYBBOLIQUES

121

L’analyse chroinatographique des pigments estérifiés d ’Haliolis crache-

rodii permet de séparer un biochrome principal rouge violet, que nous dé¬

nommons haliolivioline, et diverses fractions colorées : l’une verte, l’autre

violette et la dernière jaune orange. Ces divers biochromes, qui cons¬

tituent une nouvelle série de pigments biliaires, sont étroitement liés les uns

aux autres. En effet, un pigment jaune orange, identique au biochrome natu¬

rel, est obtenu par réduction de l’haliotivioline à l’aide d’hydrosulfite de

sodium. De même la réduction du bilirubinoïde vert conduit à un pigment

jaune orange analogue aux précédents. Enfin les propriétés du biochrome

violet sont comparables à celles de l’haliotivioline et seule l’analyse chroma-

tographique permet de différencier ces deux bilirubinoîdes. En outre, une

étude préliminaire montre l’existence d’une certaine parenté entre les pig¬

ments d 'Haliolis rufescens et d'H. cracherodii.

Les réactions et les spectres d’absorption dans l’ultra-violet et le visible

de ces divers pigments sont étudiés en détail. Par leurs propriétés générales

■ls s’apparentent aux bilirubinoîdes actuellement connus, mais ils s’en dis¬

tinguent par diverses particularités. C’est ainsi que par l’ensemble de ses

réactions et de ses spectres le pigment verl se rattache à la classe des verdines,

c est-à-dire des bilirubinoîdes à structure bila-triène. Il donne en effet la

réaction de Gmelin et présente des spectres analogues à ceux de la bili-

verdine. Cependant, bien que donnant le spectre d’absorption caractéris¬

tique de la réaction iodo-zincique, il ne montre aucune fluorescence ; en

°utre ses solutions neutres présentent un décalage exceptionnel des maxima

d’absorption vers les grandes longueurs d’ondes. Le pigment violet ainsi que

i haliotivioline présentent les principaux caractères des bilirubinoîdes de

la classe des violines (bila-diène (a, b)) ; ils s’en distinguent cependant par

leurs maxima d’absorption et par l’absence de fluorescence de leur sel de

z mc. Enfin le pigment jaune orange, qui donne les phases verte, bleue, vio¬

lette, rouge et orange de la réaction de Gmelin, appartient à la classe des

r ubincs (bila-diène (a, c)) ; les maxima d’absorption de ses solutions se situent

dans la même région du spectre que ceux de la bilirubine. Toutefois, de même

dans le cas du pigment vert, aucune fluorescence n’apparaît au cours

de la réaction iodo-zincique. En outre, l’une des particularités du pigment

Jaune orange réside dans les changements de teintes et les modifications

8 Pectroscopiques présentés par ses solutions lorsque la polarité du solvant

Varie.

Aucune constatation de cet ordre n'avait encore été faite dans la série des

pigments biliaires ; par contre, des modifications semblables ont été signa¬

lées chez certains caroténoïdes possédant une fonction cétonique en conju¬

gaison avec une chaîne ayant plusieurs doubles liaisons. Les bandes d’absorp-

L°n des solutions alcooliques neutre, acide ou zincique sont déplacées vers

,:s grandes longueurs d’ondes par rapport à celles des liqueurs chlorofor¬

miques. Il semble exister un état d’équilibre entre deux structures chimiques

différentes, probablement entre une fonction cétonique et sa forme énolique.

Mémoires ou Muséum. Zoologie, l. V. 9

Source : MNHN, Paris

122

R. TIX1ËR

Nous trouvons des spectres analogues pour un pigment jaune orange, isolé

des coquilles A'Haliolis rufescens.

A partir de 10 coquilles A'Haliolis cracherodii, nous obtenons environ

25 mg. d’haliotivioline, sous forme d’un produit amorphe violet foncé.

Ayant purifié ce pigment par des chromatographies et par des précipita¬

tions successives, nous pensons l’avoir obtenu à l’état pur. Ses solubilités

sont comparables à celles des esters méthyliques des pigments biliaires.

Les valeurs analytiques trouvées pour deux préparations différentes s’ac¬

cordent avec les formules : CagH^O^N^, C3gH 48 0 12 N 4 , C 3# H 48 O ia N 4 et C S9 H 48

O u N 4 . Ces formules sont voisines de celles de l’ester méthylique d’une copro-

mésobilivioline, dont elles se distinguent cependant par la présence de

12 atomes d’oxygène au lieu de 10 pour une copromésobilivioline. Comme pour

la turboglaucobiline, nous pensons que les formules en C 8fl sont les plus pro¬

bables. Le dosage des groupes méthoxyle indique la présence de trois grou¬

pements carboxyliques ; il nous semble toutefois que cette analyse, effec¬

tuée sur une très faible quantité de pigment, manque d’exactitude et nous

accordons plus de crédit à la chromatographie de partage sur papier qui

montre l’existence de quatre fonctions acides dans l’haliotivioline. La déter¬

mination du poids moléculaire par la méthode de K. Rast s’accorde avec les

formules proposées et confirme ainsi la nature tétrapyrrolique de ce pig¬

ment. Les valeurs analytiques trouvées pour les préparations d’halioti¬

violine sont voisines de celles obtenues avec la turboglaucobiline. Ces deux

pigments, qui possèdent 12 ou 13 atomes d’oxygène dans leur molécule,

semblent appartenir, non à une même série, mais à deux familles voisines

de bilirubinoïdes.

Les spectres d’absorption des solutions neutre (rouge violet), acide (bleu)

et zincique (bleu indigo) sont examinés et comparés à ceux de la mésobiü*

violine. Ces solutions ne présentent aucune fluorescence.

L’oxydation de l’haliotivioline conduit à un pigment rouge, qui, à notre

avis, ne peut être assimilé b une uroroséine, mais doit être considéré comme

une « oxo » urobiline.

L’étude des produits de réduction de l’haliotivioline confirme, si cela

était nécessaire, la nature tétrapyrrolique de ce pigment, ainsi que sa parenté

avec les bilirubinoïdes à structure bila-diène (a, b). En effet, la réduction

à l’aide d’hydrosulfite de sodium conduit à un pigment jaune orange donnant

la réaclion de Gmelin. Les propriétés et les spectres de ce pigment sont sem¬

blables à ceux du biochrome naturel jaune orange ; l’identité de ces deux

bilirubinoïdes est établie par l’analyse chromatographique. L’une des objec¬

tions contre la nature tétrapyrrolique de l'haliotivioline est l’absence de

fluorescence de son complexe zincique ; or la réduction de ce pigment à

l’aide de poudre de zinc en milieu acétique, suivie d’une réoxydation à l’air,

conduit à des bilirubinoïdes donl les sels de zinc sont fluorescents. L’analyse

chromatographique permet de séparer un pigment rouge orange dont le

sel de zinc possède une fluorescence verte et un biochrome violet dont le

Source : MNHN, Paris

PIGMENTS TÊTRAPYRROUQUES

là»

complexe zincique présente une fluorescence rouge ; le premier de ces produits

s’apparente k l’urobiline, le second à la mésobilivioline. L'analogie des

8pectres d’absorption du biochrome violet fluorescent et de l’haliotivioline

montre que la réduction zincique n’apporte qu’une légère modification dans

la constitution chimique de l’haliotivioline.

De même que dans le cas de la turboglaucobiline, il est possible d'envisager

la présence dans l’haliotivioline de deux groupements propanoïques, renfer¬

mant des fonctions alcool secondaire. Toutefois, les modifications de spectres

observées avec le biochrome jaune orange sont en faveur de l’existence

d’au moins une fonction cétonique plutôt que d’un groupe alcoolique dans

l’une des chaînes latérales oxypropanoïques des bilirubinoïdes d ’Haliolis

craclierodii. Le déplacement des bandes d’absorption du pigment jaune

orange vers la partie rouge du spectre, lorsque le solvant est polaire, s’expli¬

querait ainsi par l’apparition d’une double liaison, due à l'énolisation de

la fonction cétonique. Nous exposons finalement une hypothèse susceptible

d’expliquer à la fois les analogies et les différences observées entre les pro¬

priétés de l’haliotivioline et des autres bilirubinoïdes naturels.

En résumé, si le présent travail ne permet pas d’attribuer des formules

définitives aux pigments biliaires des coquilles de Mollusques, il précise

leurs propriétés et leur filiation, donne un premier aperçu de leur constitu-

lion chimique et propose des hypothèses devant aider à l’orientation de

recherches ultérieures. En outre, il montre l’existence dans le règne animal

de pigments biliaires, dont la constitution chimique est différente de celle

des bilirubinoïdes actuellement connus. Nous pensons que l’origine des

Porphyrines et des pigments biliaires des coquilles de Mollusques pourrait

etre recherchée dans des phénomènes de biosynthèse, actuellement rudimen¬

taires et sans utilité pour l'animal.

Au cours de ces recherches, nous avons appliqué pour la première fois

l'analyse chromatographique de partage sur papier à l’étude des pigments

biliaires. Cette technique permet de déterminer le nombre de groupes carbo¬

niques des pigments étudiés, d’avoir une caractéristique de ces biochromes

un critère de leur pureté. Elle est susceptible de rendre de grands services

dans la caractérisation des bilirubinoïdes naturels.

Dans la deuxième partie de cet exposé, nous étudions les porphyrines de

l’ambre gris. Nous montrons que le pigment, dénommé ambraporphyrine

Par Y. Okahara et considéré par H. Fischer comme une nouvelle porphy-

rin e, est en réalité un mélange de proioporphgrine IX et de mésoporphyrine IX.

Cas deux pigments, malgré leur constitution voisine, peuvent être séparés

Par chromatographie sur alumine ; en effet, la protoporphyrine, qui possède

deux groupes vinyliques à la place des radicaux éthyle de la mésoporphy-

ni *e, est plus fortement adsorbée. Ces deux porphyrines sont caractérisées

Par leur point de fusion, leur analyse élémentaire et leur spectre d’absorption

dans le visible. Leur étude est poursuivie conjointement avec celle des esters

inéthyliques d’une protoporphyrine et d’une mésoporphyrine, préparées

Source : MNHN, Paris

124 K. TIXIER

à partir de l’hémine (comparaison des aspects cristallins, points de fusion

et chromatographies mixtes).

A 1 kg. d’ambre gris correspond environ 30 mg. de protoporphyrine

et 10 mg. de mésoporphyrine. La présence dans l’ambre gris de becs de

Seiche, pouvant provoquer des hémorragies dUns l’intestin du Cachalot,

permet de penser que la protoporphyrine provient de la transformation

de l’hémoglobine par les bactéries intestinales, une partie de la protopor¬

phyrine étant ensuite réduite en mésoporphyrine.

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Source : MNHN, Paris